中醫(yī)熱毒血瘀證表征大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血小板功能的病理變化

熱毒血瘀證是中醫(yī)學(xué)熱毒阻滯（血液）的常見(jiàn)癥候。熱盛傷津耗液使血液黏稠,熱盛灼傷脈絡(luò)使血行不利,熱盛迫血妄行使血液離經(jīng),熱盛阻遏氣機(jī)以致氣滯,這些過(guò)程均可導(dǎo)致血瘀。本課題組通過(guò)腹腔注射內(nèi)毒素即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),初步建立了熱毒血瘀證大鼠模型。該模型較好地模擬了中醫(yī)有關(guān)外邪入侵、熱毒熾盛、熱盛為毒、煉血成瘀的疾病演變過(guò)程,比較符合中醫(yī)的熱毒血瘀證形成理論;同時(shí),該模型除展示出一系列類似中醫(yī)熱毒血瘀證的臨床癥狀外,還提供了血液流變學(xué)、炎癥因子、血脂變化等指標(biāo),為中醫(yī)熱毒血瘀證提供了部分客觀生物醫(yī)學(xué)依據(jù)。可以說(shuō),該模型較好地克服了既往熱毒血瘀證動(dòng)物模型穩(wěn)定性差、存活時(shí)間短、模擬的癥狀不甚符合中醫(yī)臨床標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)以及客觀檢測(cè)指標(biāo)不夠統(tǒng)一的缺點(diǎn)。因此,在該模型上進(jìn)一步觀察發(fā)掘生物醫(yī)學(xué)指標(biāo)對(duì)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀念理解血瘀證本質(zhì)具有重要意義。血漿內(nèi)皮素(ET)、熱休克蛋白70(HSP70)、血栓烷B2(TXB2)和6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1α)是四種與血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)損傷和血小板活化密切相關(guān)的生物活性物質(zhì)。其中,ET是目前已知的最強(qiáng)的血管收縮劑,是VEC損傷時(shí)表達(dá)的重要因子。HSP70具有重要的抗氧化損傷作用,反應(yīng)了機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度。血栓素A2(TXA2)由血小板產(chǎn)生,具有強(qiáng)烈的促血小板聚集和促血管收縮作用。前列環(huán)素(PGI2)由VEC合成,具有強(qiáng)烈的抑制血小板聚集和擴(kuò)張血管的作用,代謝產(chǎn)物分別為TXB2和6-Keto-PGF1α,其比值可反應(yīng)血小板活化情況。為此,本研究擬通過(guò)行為學(xué)分析、舌體組織血氧飽和度測(cè)定等進(jìn)一步觀察模型血漿ET、TXB2、6-Keto-PGF1α與中醫(yī)熱毒血瘀證的關(guān)系,探討熱毒血瘀證的現(xiàn)代病理生理基礎(chǔ)。1動(dòng)物分組、模型制備和局部血氧監(jiān)護(hù)1.1實(shí)驗(yàn)材料SPF級(jí)雄性Sprague-Dewley(SD)大鼠,體重190g~210g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京2002—0003)。脂多糖來(lái)源于菌株Escherichiacoli055:B5,購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。數(shù)碼攝像機(jī)選自日本SONY公司。動(dòng)物行為軌跡分析軟件購(gòu)自EthoVision,version3.1,Noldus公司。ET放免藥盒、6-Keto-PGF1α放免藥盒及TXB2放免藥盒購(gòu)自解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所。計(jì)數(shù)器選自西安凱普機(jī)電有限責(zé)任公司,型號(hào)FM-2000。HSP70酶標(biāo)免疫藥盒購(gòu)自USCNLIFESCIENCE&TECHNOLOGYCOMPANY,選用ThermoLabsystems酶標(biāo)儀,型號(hào):MultiskanMK3。ODISseyTM局部組織血氧監(jiān)護(hù)儀由北京中沃科技有限公司提供。1.2動(dòng)物模型制備LPS注射液用無(wú)熱源生理鹽水配制成,濃度為2.5mg/mL。SD大鼠108只,自由飲食、進(jìn)水,按隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為模型組(60只)和正常組(48只)。模型組又隨機(jī)分為注射LPS后3h、1d、1周、2周、4周及8周共6個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只大鼠。分別于腹腔注射LPS(2.5mg/kg,2次/周)后不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物,處死前禁食12h,自由飲水,嚴(yán)格按照無(wú)菌操作規(guī)程從頸總動(dòng)脈取血,分血清生化管(非抗凝)存放。模型組各時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)置正常組8只大鼠,腹腔注射無(wú)熱源生理鹽水2.5mg/kg(2次/周),分別腹腔注射生理鹽水后與模型組相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)同步處死動(dòng)物,取血。1.3行為學(xué)分析給藥后1周、2周、4周、8周各記錄大鼠行為軌跡。將大鼠放置于相同的無(wú)蓋盒子內(nèi)(30cm×30cm),5min后用SONY數(shù)碼攝像機(jī)從盒子上方記錄大鼠在30min內(nèi)的活動(dòng)情況,使用動(dòng)物行為軌跡分析軟件測(cè)得大鼠30min內(nèi)在盒子內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離(cm)和平均速度(cm/s),圖像采集6楨/秒。記錄均在10:00進(jìn)行。1.4舌體組織血氧飽和度測(cè)定大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)處死前1d,用0.6%水合氯醛溶液,按100g體重0.6mL腹腔注射麻醉,在室溫環(huán)境下,將大鼠仰臥置于操作臺(tái)上,將舌體輕輕拉出,以組織血氧測(cè)量?jī)x的探頭固定于大鼠舌體中部,壓力以剛好接觸舌體為度,接觸面積達(dá)80%以上為標(biāo)準(zhǔn),記錄當(dāng)時(shí)的血氧飽和度值。1.5血漿檢測(cè)指標(biāo)放射性免疫學(xué)方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)血漿ET、6-Keto-PGF1α、TXB2;酶聯(lián)免疫學(xué)方法檢測(cè)HSP70。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1模型大鼠運(yùn)動(dòng)速度和組織血氧飽和度模型組給藥后2周、4周、8周大鼠30min內(nèi)在盒內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離與正常組相比均有所減少(P<0.05);給藥后1周、2周、4周、8周模型組大鼠平均運(yùn)動(dòng)速度與正常組相比明星降低(P<0.05或P<0.01);模型組大鼠的運(yùn)動(dòng)距離和平均速度隨時(shí)間推移逐漸變小。給藥后8周模型組大鼠舌體組織血氧飽和度較正常組顯著降低(P<0.01)。模型組大鼠的舌體組織血氧飽和度隨時(shí)間推移逐漸降低。詳見(jiàn)表1。2.2給藥后大鼠血清6-keto-pgf1和txb2表達(dá)變化給藥3h模型組大鼠血清ET的濃度與正常組相比顯著升高(P<0.01),給藥1d、1周、2周模型組大鼠血清HSP70的濃度與正常組相比升高明顯(P<0.05或P<0.01)。給藥后1d、2周模型組大鼠血清6-Keto-PGF1α濃度與正常組相比降低(P<0.05),而TXB2與正常組相比則升高(P<0.05);給藥后8周模型組大鼠血清6-Keto-PGF1α濃度與正常組相比升高(P<0.01);給藥后1d、2周模型組大鼠TXB2/6-Keto-PGF1α與正常組相比升高(P<0.05),8周時(shí)與正常組相比則降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。3中醫(yī)熱毒瘀證模型的現(xiàn)代意義中醫(yī)認(rèn)為,熱毒熾盛是熱毒血瘀證形成的基本病因。熱邪深入營(yíng)血分,化火成毒,灼傷陰血,煉熬血液,臟腑脈絡(luò)受損,進(jìn)而導(dǎo)致熱瘀交結(jié)的病理狀態(tài)。由LPS引發(fā)的持續(xù)內(nèi)毒素血癥,可以導(dǎo)致組織器官的缺血、缺氧、血循環(huán)障礙等方面的異常。根據(jù)中醫(yī)理論,內(nèi)毒素應(yīng)屬熱邪、毒邪因素,故持續(xù)注射一定時(shí)間后,大鼠即表現(xiàn)出很類似中醫(yī)血瘀證的癥狀,如體重增加緩慢、進(jìn)食下降并活動(dòng)減少、皮毛變得枯黃、爪甲由淡粉色變枯燥、尾部光澤減退并逐漸呈紫暗色、眼睛分泌物增多、大便臭穢、多處于閉目無(wú)精神狀。從中醫(yī)注重的舌象來(lái)看,可以看到大鼠舌質(zhì)從最初紅潤(rùn)逐漸變暗,津液減少,舌下靜脈變長(zhǎng)。血液流變學(xué)檢測(cè)則發(fā)現(xiàn)1周~4周血液黏度及紅細(xì)胞功能有改變,4周~8周血小板聚集增強(qiáng)伴血漿黏度升高,特別是血脂升高。鑒于魏海峰等已經(jīng)證實(shí)測(cè)定舌體組織血氧飽和度是評(píng)價(jià)血瘀證舌暗的有效方法,因此,在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)行為學(xué)分析和測(cè)定舌體組織血氧飽和度對(duì)以前獲得的表征進(jìn)一步進(jìn)行了量化,發(fā)現(xiàn)注射LPS的模型大鼠的運(yùn)動(dòng)距離、速度顯著下降,它們的舌體組織血氧飽和度隨時(shí)間推移逐漸下降,在8周時(shí)下降特別明顯,這與通過(guò)舌像攝影所獲得的結(jié)果基本一致,和大鼠的運(yùn)動(dòng)距離、速度也存在一定相關(guān)性。本研究從病因、表征、血液流變學(xué)不同方面進(jìn)一步說(shuō)明我們以往建立的中醫(yī)熱毒血瘀證大鼠模型是符合中醫(yī)理念的,能夠較好地模擬中醫(yī)熱毒血瘀證慢性發(fā)展變化的過(guò)程。也就是說(shuō),從該模型身上進(jìn)一步挖掘各種現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)指標(biāo)應(yīng)該能深入解密中醫(yī)熱毒血瘀證的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)含義。血管和血液應(yīng)該是考慮炎癥與血瘀證關(guān)系的重要靶點(diǎn)。在LPS刺激下,VEC大量分泌白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細(xì)胞因子,它們可作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱;TNF-α、IL-1還可刺激VEC和白細(xì)胞釋放一系列炎性介質(zhì)(如NO、氧自由基等),通過(guò)協(xié)同作用改變凝血功能,導(dǎo)致組織損傷及彌漫性血管內(nèi)凝血,故在感染性休克中起重要作用。LPS作用于VEC還可迅速引起細(xì)胞骨架蛋白的解聚和重組,細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基底膜間的黏附連接松解,形成細(xì)胞間隙,導(dǎo)致微血管通透性升高。VEC的存在為維持正常血液流動(dòng)狀態(tài)所必需,其損傷可造成許多疾病發(fā)生發(fā)展,特別是血管性疾病。本研究結(jié)果顯示,腹腔注射LPS3h后模型大鼠血漿ET濃度顯著升高,這說(shuō)明VEC有受損現(xiàn)象。因?yàn)閂EC受損可表現(xiàn)分泌功能異常及血管通透性改變,進(jìn)而會(huì)引發(fā)血液成分、血流變特性和血小板功能的改變;類似血漿ET升高的現(xiàn)象也能在血瘀證患者中看到。這說(shuō)明,現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)所看到的內(nèi)皮細(xì)胞損傷表現(xiàn)與中醫(yī)的血瘀證有密切相關(guān)性。許多人認(rèn)為,中醫(yī)學(xué)所認(rèn)識(shí)有關(guān)“絡(luò)”的概念在形態(tài)、功能上都和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微小血管的概念有相通之處,故可以認(rèn)為VEC的損傷與“絡(luò)病”的發(fā)生關(guān)系密切。這也反過(guò)來(lái)說(shuō)明用LPS來(lái)?yè)p傷VEC以復(fù)制熱毒血瘀模型是可行的,符合熱毒血瘀證的“熱毒傷絡(luò)”病機(jī)。隨后的1周~8周則未檢測(cè)到ET的顯著性變化,這可能是大鼠對(duì)內(nèi)毒素有耐受的結(jié)果。盡管體內(nèi)ET變化不明顯,但在LPS反復(fù)作用下,VEC損傷應(yīng)該持續(xù)存在。同時(shí),在1d、1周、2周時(shí)模型組大鼠血清HSP70的濃度升高,說(shuō)明模型在該時(shí)間段內(nèi)存在較強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng),并可能造成VEC的急性損傷。本模型的炎癥反應(yīng)和VEC損傷可能互為因果,成為致瘀的始動(dòng)因素。自由基、炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素等致病因素均可作用于VEC,引起其功能失衡及通透性變化,促成微血栓形成,引發(fā)或加重血管損傷及循環(huán)障礙,即所謂“邪熱傷絡(luò),血溢致瘀”。由內(nèi)毒素使機(jī)體釋放的多種炎癥介質(zhì)可在內(nèi)皮和單核細(xì)胞表面誘導(dǎo)組織因子(TF)的表達(dá),這又可以啟動(dòng)凝血,內(nèi)皮細(xì)胞受損、內(nèi)皮下膠原暴露也能啟動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑,引起血小板活化,促進(jìn)血栓形成。生理狀態(tài)下,TXA2及PGI2兩者保持一定的比例,維持血液循環(huán)的穩(wěn)定。在病理情況下,血小板產(chǎn)生的TXA2明顯減少或VEC產(chǎn)生的PGI2相對(duì)過(guò)多,就會(huì)導(dǎo)致出血傾向;反之,PGI2分泌減少,TXA2增多則可導(dǎo)致血管痙攣加重,血栓形成加速,后者又繼發(fā)性激活血小板,催化釋放腎上腺素,反饋加速血小板聚集和血栓形成。已有研究發(fā)現(xiàn),血瘀證與血漿TXA2-PGI2平衡失調(diào)密切相關(guān)。本研究1d、2周時(shí)TXB2/6-Keto-PGF1α顯著升高、8周時(shí)顯著降低,表明早期模型大鼠在炎癥、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮細(xì)胞損傷多種因素刺激下有血小板活化,導(dǎo)致血管收縮、微循環(huán)中血小板黏附聚集而阻滯血流;后期則可能有體內(nèi)微循環(huán)障礙、血栓形成、血小板活化程度下降,一方面使血管擴(kuò)張、通透性增加,另一方面