氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定龍井茶香氣成分

保留指數(shù)法是氣相色譜中常用的定性方法，具有良好的精度和再現(xiàn)性。保留指數(shù)反映的是化合物與固定相的相互作用,當(dāng)固定相相同時(shí),這種相互作用僅與化合物的拓?fù)?、幾何和電性特征相關(guān)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中計(jì)算得到的保留指數(shù),對(duì)照相應(yīng)保留指數(shù)庫(kù)或文獻(xiàn)中的保留指數(shù)數(shù)據(jù),即可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行有效地鑒定。譜庫(kù)檢索和保留指數(shù)鑒定相結(jié)合能在一次色譜分析過程中同時(shí)應(yīng)用,充分發(fā)揮兩種方法各自的優(yōu)勢(shì),提高分析效率,大大增加定性分析的準(zhǔn)確性和可靠性。茶葉香氣組分存在大量的同分異構(gòu)體,因此,在茶葉香氣成分的分析鑒定過程中,僅靠譜庫(kù)檢索難以得到準(zhǔn)確和可靠的鑒定。而國(guó)內(nèi)茶葉香氣成分的研究對(duì)保留指數(shù)的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用甚少。本章研究應(yīng)用保留指數(shù)法對(duì)茶葉香氣成分進(jìn)行定性鑒定,對(duì)其準(zhǔn)確性、可靠性進(jìn)行探討,特別是在同分異構(gòu)的定性鑒定方面。此外,保留指數(shù)庫(kù)通常并不免費(fèi),且文獻(xiàn)檢索又非常繁瑣。因此,針對(duì)茶葉香氣研究中較常用的HP-innowax極性色譜柱,總結(jié)近年來相關(guān)文獻(xiàn),開發(fā)了此色譜柱的保留指數(shù)庫(kù),為相關(guān)研究提供借鑒。1材料和方法1.1儀器、試瓶和測(cè)試瓶SPME手持器(SAAB-57330U)和65μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取頭(美國(guó)Supelco公司);6890氣相色譜-5973質(zhì)譜儀(Agilent公司);自制改良頂空瓶(容積150mL玻璃試驗(yàn)瓶);HH-2型可控?cái)?shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠);正構(gòu)烷烴混標(biāo)(n-alkane,C8~C20,Sigma-Aldrich,USA);供試用的龍井茶樣(春茶,特級(jí))產(chǎn)自淳安縣,由杭州慧龍茶葉有限公司提供,以鋁箔袋密封,保存于4℃冰柜中待用。1.2spme-dvb萃取纖維準(zhǔn)確稱取10g龍井茶樣品放入萃取瓶中,加入30mL沸水,60℃下靜置5min,然后將裝有100μmPDMS/DVB萃取頭(實(shí)驗(yàn)前老化5min)的SPME手持器通過瓶蓋的橡皮墊插入到萃取瓶中,推出纖維頭,吸附1h后進(jìn)行GC-MS分析。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。1.3gc-ms分析條件龍井茶揮發(fā)物分析的GC條件:升溫程序?yàn)?0℃保持5min,以5℃·min-1升溫至220℃(不保持),進(jìn)樣口溫度220℃。色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱,30m×0.25mm×0.25μm,以高純度氦氣(純度>99.999%)作為載氣(流速1.0mL·min-1)。正構(gòu)烷烴混標(biāo)分析的GC條件:升溫程序?yàn)?0℃保持5min,以3℃·min-1升溫至220℃(保持5min),再以10℃·min-1升溫至240℃(保持5min)。進(jìn)樣口溫度220℃。色譜柱為HP-innowax色譜柱,30m×0.25mm×0.25μm,以高純度氦氣(純度>99.999%)作為載氣(流速1.0mL·min-1)。MS條件:離子源溫度200℃,電離方式EI,電子能量70eV,掃描質(zhì)量范圍35~400amu;進(jìn)樣方式為直接將SPME手持器插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口,推出纖維頭,于220℃解吸附3.5min。1.4揮發(fā)性成分的檢測(cè)利用NIST98.L質(zhì)譜庫(kù)對(duì)得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行串連檢索和人工解析。查對(duì)有關(guān)質(zhì)譜資料,對(duì)基峰、質(zhì)荷比和相對(duì)峰度等方面進(jìn)行分析,結(jié)合保留時(shí)間和質(zhì)譜分別對(duì)各峰加以確認(rèn)。采用峰面積歸一化法定量,得到各組分的相對(duì)含量(組分峰面積占總峰面積的百分比)。MS峰鑒定:利用NIST98.L譜庫(kù)對(duì)得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行串連檢索和人工解析,質(zhì)譜匹配度大于90%作為物質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)。保留指數(shù)鑒定:1μL正構(gòu)烷烴混標(biāo)按香氣成分測(cè)定時(shí)的程序升溫進(jìn)行分析,測(cè)定其相同升溫程序下的保留時(shí)間;在合理得到正構(gòu)烷烴混標(biāo)的保留時(shí)間后,可根據(jù)公式(1)計(jì)算相同色譜柱和升溫程序下?lián)]發(fā)性成分的保留指數(shù),再查詢文獻(xiàn)中的保留指數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行物質(zhì)鑒定。注:n:目標(biāo)化合物流出的前一個(gè)正構(gòu)烷烴所含碳原子數(shù)目;RTunknown:目標(biāo)化合物的保留時(shí)間;RTsmalleralkane:目標(biāo)化合物流出的前一個(gè)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間;RTlargeralkane:目標(biāo)化合物流出的后一個(gè)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。1.5文獻(xiàn)過濾的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)檢索與過濾:收集Sciencedirect和ACS文獻(xiàn)庫(kù)中利用HP-innowax色譜柱分析揮發(fā)物成分的研究文獻(xiàn),按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行文獻(xiàn)的過濾:(1)文獻(xiàn)必須有HP-innowax色譜柱的物質(zhì)保留指數(shù)數(shù)據(jù);(2)保留指數(shù)是通過與正構(gòu)烷烴混標(biāo)對(duì)比計(jì)算得到;(3)保留指數(shù)整體上明顯與其他文獻(xiàn)有較大偏差的文獻(xiàn)予以排除。經(jīng)過濾,得到符合條件的文獻(xiàn)90篇。數(shù)據(jù)庫(kù)的建立:收集文獻(xiàn)中常見揮發(fā)物的保留指數(shù)數(shù)據(jù),計(jì)算其平均值、最大值、最小值和頻率最高值,并按均值±2.5%剔除異常值。2結(jié)果與分析2.1保留指數(shù)的測(cè)量2.1.1碳數(shù)與正構(gòu)烷烴參照的關(guān)系利用Lucero等設(shè)計(jì)的保留指數(shù)工作表,將正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間導(dǎo)入,作為相同升溫程序下保留指數(shù)計(jì)算的保留時(shí)間參照點(diǎn)。在本次試驗(yàn)條件下,只得到了C11~C20保留時(shí)間數(shù)據(jù)。為了檢驗(yàn)正構(gòu)烷烴參照的有效性,檢驗(yàn)了其保留時(shí)間與碳數(shù)之間的線性相關(guān)性。存在異常點(diǎn)或相關(guān)系數(shù)(R2)過小則表明色譜系統(tǒng)或物質(zhì)鑒定中存在一定問題。本實(shí)驗(yàn)中10個(gè)正構(gòu)烷烴測(cè)得的保留時(shí)間相對(duì)其碳數(shù)的線性相關(guān)系數(shù)(R2)達(dá)到0.998(回歸方程:y=235.295x-2231.545),證實(shí)了測(cè)定方法的可靠性,以及這些正構(gòu)烷烴作為保留指數(shù)測(cè)算參照點(diǎn)的有效性。2.1.2根據(jù)分析中的正構(gòu)烷烴測(cè)定保留指數(shù)2.2保護(hù)指數(shù)用于評(píng)價(jià)茶葉的香氣成分2.2.1物質(zhì)定性鑒定譜庫(kù)檢索是GC-MS技術(shù)的常規(guī)定性方法,采用與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)匹配的方法對(duì)化合物進(jìn)行鑒定,匹配度越高,定性的可靠性就越高。本試驗(yàn)中,要求這些進(jìn)行物質(zhì)鑒定的峰,其譜庫(kù)檢索結(jié)果中至少存在匹配度>80%的化合物;經(jīng)譜庫(kù)檢索和過濾,龍井茶樣頂空揮發(fā)物中共有75個(gè)峰達(dá)到了鑒定要求。首先,應(yīng)用譜庫(kù)檢索(MS鑒定)對(duì)這75個(gè)峰進(jìn)行了物質(zhì)定性鑒定,其中35個(gè)峰得到了完全的鑒定(除了個(gè)別同分異構(gòu)體,如No.17和No.63)。而在鑒定過程中,發(fā)現(xiàn)有27個(gè)峰存在幾個(gè)匹配度都非常高(如>90%)的化合物與之對(duì)應(yīng),將之定義為半鑒定(Partiallyidentified)。半鑒定的峰在揮發(fā)物分析過程中非常常見,僅依靠譜庫(kù)匹配度很難對(duì)它們進(jìn)行有效鑒定,且容易出現(xiàn)定性錯(cuò)誤。接著,采用保留指數(shù)法對(duì)所有的峰再進(jìn)行定性鑒定。參照公式(1),計(jì)算得到所有峰的保留指數(shù),見表1中RI(cal.)。通過檢索相關(guān)文獻(xiàn),查找所有峰的匹配度較高(>80%)化合物的保留指數(shù)RI(ref.),并與實(shí)測(cè)保留指數(shù)RI(cal.)進(jìn)行對(duì)比,從而進(jìn)行物質(zhì)定性鑒定。經(jīng)鑒定,75個(gè)峰中的56個(gè)得到了完全鑒定,在譜庫(kù)檢索的基礎(chǔ)上增加了21個(gè);另外,12個(gè)峰為半鑒定,這些峰存在幾個(gè)匹配度較高的化合物,其RI(ref.)與RI(cal.)較為接近,仍然不能作出有效的鑒定。顯然,僅僅采用譜庫(kù)檢索,其物質(zhì)定性鑒定結(jié)果很難讓人滿意;而結(jié)合保留指數(shù)法進(jìn)行鑒定后,大多數(shù)物質(zhì)都得到了完全的鑒定,鑒定效率大大提高。2.2.2質(zhì)譜條件的確定揮發(fā)物鑒定過程中,部分同分異構(gòu)體的質(zhì)譜圖很相似,僅依靠譜庫(kù)檢索很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定性。而根據(jù)保留指數(shù)性質(zhì),在相同色譜條件下,不同化合物具有不同的保留指數(shù),通過與文獻(xiàn)保留指數(shù)值對(duì)比,就能對(duì)質(zhì)譜匹配過程中存在的同分異構(gòu)體進(jìn)行有效的鑒定,提高物質(zhì)定性的準(zhǔn)確性,使物質(zhì)鑒定效率大大提高。如實(shí)驗(yàn)中測(cè)得保留時(shí)間為37.40min的46號(hào)峰(表1),經(jīng)譜庫(kù)檢索后,γ-依蘭油烯和γ-杜松烯(99%)兩種物質(zhì)的匹配度都達(dá)到99%。46號(hào)峰與γ-依蘭油烯、γ-杜松烯的質(zhì)譜如圖1所示,顯然非常相似,僅依靠質(zhì)譜相似性是無法作出準(zhǔn)確鑒定的。實(shí)驗(yàn)中計(jì)算得到46號(hào)峰在HP-5MS色譜柱上的RI值為1476;通過文獻(xiàn)查閱,γ-依蘭油烯和γ-杜松烯的RI值分別為1481和1519;顯然,46號(hào)峰的RI值與γ-依蘭油烯非常接近,此峰可被鑒定為γ-依蘭油烯。2.3文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的整理和補(bǔ)充采用保留指數(shù)法進(jìn)行物質(zhì)定性的過程中,需要查找相應(yīng)物質(zhì)的保留指數(shù),或查詢相關(guān)保留指數(shù)庫(kù)(如集成于NIST庫(kù)的保留指數(shù)庫(kù);Adams保留指數(shù)庫(kù)),或查找相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)。保留指數(shù)庫(kù)中HP-innowax色譜柱的保留指數(shù)數(shù)據(jù)較少,不能滿足實(shí)驗(yàn)的要求,且這些數(shù)據(jù)庫(kù)并不免費(fèi),查詢途徑受限。另外,文獻(xiàn)數(shù)據(jù)則由于其龐大的文獻(xiàn)而極有可能出現(xiàn)數(shù)值上的差異,因此非常有必要進(jìn)行文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的整理,使文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的引用更嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)。HP-innowax色譜柱是鍵合/交聯(lián)聚乙醇固定相的色譜柱,具有很好的惰性,對(duì)各種極性化合物如酸、醛和醇類都可以得到很銳的峰形。它可以經(jīng)受多次進(jìn)水樣和溶劑樣品,溫度上限極高并且其流失性是所有wax-型固定相中最低的一種,是分離高沸點(diǎn)化合物理想的色譜柱。HP-innowax色譜柱非常適合分析茶葉香氣成分;可能由于推廣時(shí)間還較短,HP-innowax色譜柱相關(guān)的保留指數(shù)文獻(xiàn)并不多。通過對(duì)相應(yīng)文獻(xiàn)進(jìn)行合理的篩選,再對(duì)文獻(xiàn)中的保留指數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總、計(jì)算和歸納,開發(fā)一個(gè)小型的HP-innowax色譜柱的保留指數(shù)庫(kù),包括來源的文獻(xiàn)、RI數(shù)值、柱參數(shù)、升溫程序等。表2列出了數(shù)據(jù)庫(kù)中73種HP-innowax柱常檢測(cè)到的揮發(fā)物成分的RI數(shù)據(jù),包括了數(shù)據(jù)量、RI平均值、范圍以及頻率出現(xiàn)最高的RI值等,共1673個(gè)RI數(shù)據(jù)。3質(zhì)譜匹對(duì)和保留指數(shù)相結(jié)合的物質(zhì)鑒定方法的改進(jìn)本研究利用正構(gòu)烷烴混標(biāo)(n-alkanes)和分析物體系中的正構(gòu)烷烴進(jìn)行揮發(fā)物保留指數(shù)的計(jì)算,兩種計(jì)算方法的精度都達(dá)到了滿意的效果,適合在茶葉香氣成分分析中進(jìn)行應(yīng)用。譜庫(kù)檢索結(jié)合保留指數(shù)法能大大提高茶葉揮發(fā)物的物質(zhì)鑒定效率,同時(shí),對(duì)同分異構(gòu)體的鑒定也非常有效。開發(fā)的針對(duì)HP-innowax色譜柱的RI庫(kù),包括了常檢測(cè)到的73種成分的1673個(gè)RI數(shù)據(jù),提供了RI均值和RI范圍等信息,可以為利用HP-innowax色譜柱進(jìn)行的揮發(fā)物分析提供參考,提高了物質(zhì)鑒定效率。根據(jù)計(jì)算得到的保留指數(shù)值,可以查詢相關(guān)保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)或者文獻(xiàn)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行鑒定。物質(zhì)的有效鑒定通常需要結(jié)合兩種及以上的分析方法。而質(zhì)譜匹對(duì)和保留指數(shù)鑒定相結(jié)合則能在一次色譜分析過程中同時(shí)應(yīng)用,從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行有效鑒定。特別是在相同色譜柱中,幾種物質(zhì)具有相似的質(zhì)譜時(shí)(如同分異構(gòu)體),保留指數(shù)能進(jìn)行有效的鑒定。而不同固定相色譜柱保留指數(shù)的結(jié)合分析則能更有效地進(jìn)行物質(zhì)鑒定。本試驗(yàn)中采取的鑒定標(biāo)準(zhǔn)是:質(zhì)譜匹配系數(shù)>0.90,以及保留指數(shù)誤差在10單位以內(nèi)。譜庫(kù)檢索結(jié)合保留指數(shù)法能顯著提高茶葉揮發(fā)物的物質(zhì)鑒定效率,然而仍然有一部分物質(zhì)未能得到有效鑒定。這可能是由于質(zhì)譜庫(kù)版本較低(本實(shí)驗(yàn)中為NIST98,而最新的為NIST08)造成。此外,實(shí)驗(yàn)過程也可以結(jié)合使用不同類型固定相的色譜柱對(duì)同一樣品進(jìn)行分析,也可以使揮發(fā)物鑒定更全面,進(jìn)一步提高物質(zhì)的鑒定效果。開發(fā)的針對(duì)HP-innowax的保留指數(shù)庫(kù),使物質(zhì)鑒定更便捷、更科學(xué);同時(shí)也應(yīng)該注意到,保留指數(shù)庫(kù)中只包括了常檢測(cè)到的揮發(fā)物成分,也只歸納了Sciencedirect和ACS文獻(xiàn)庫(kù)中的相關(guān)文獻(xiàn);下一步有必要檢索更多的相關(guān)文獻(xiàn),并歸納更多的揮發(fā)物成分的RI數(shù)據(jù),使數(shù)據(jù)庫(kù)更趨于完善。正構(gòu)烷烴混標(biāo)的應(yīng)用是保留指數(shù)中最常用的方法,而實(shí)際上,在計(jì)算保留指數(shù)時(shí),有相