模擬酸雨對毛竹葉片綠素釋放的影響

隨著工業(yè)的快速發(fā)展，酸沉降日益嚴重，已成為全球環(huán)境污染因素之一。目前中國是繼歐洲和北美之后世界第三大酸雨集聚區(qū)(張新民等,2010;Chenetal.,2012;Cuculovicetal.,2014),且酸沉降區(qū)域還在不斷擴大(Malakoff,2010)。酸雨使植物葉片變黃脫落,甚至造成森林成片衰亡,由酸雨導致的植物傷害、生態(tài)平衡破壞、經濟損失等諸多問題已引起人們廣泛的關注(Shuklaetal.,2013)。酸雨能夠破壞植物葉片結構(Sant’Anna-Santosetal.,2006;Wangetal.,2012)、降低葉綠素含量(陳威等,2008)、影響光合作用(宋莉英等,2013)、增大葉片細胞膜透性(馮麗麗等,2011)、影響植物酶活性(Ková?iketal.,2011;水德聚等,2012)等。研究表明,已經沉降在森林中的大氣酸性物質對生態(tài)系統(tǒng)的影響仍會持續(xù)數(shù)十年(Reisetal.,2012)。植物揮發(fā)性有機化合物(volatileorganiccompounds,VOCs)可自發(fā)生成,也有多種外界因素誘導產生,其中誘導植物產生VOCs的環(huán)境因素分為生物因素和非生物因素(左照江等,2010;Copolovicietal.,2014)。植物VOCs不僅參與其直接防御過程,還可通過誘導防御相關基因表達促進防御化合物累積,在植物間接防御過程中發(fā)揮著重要作用(孫海峰等,2013)。綠葉揮發(fā)物(greenleafvolatiles,GLVs)是多烯脂肪酸(polyenoicfattyacids,PUFA)被氧化的衍生物,是具有順,順-1,4-戊二烯結構的多聚不飽和脂肪酸加氧反應生產的含氧VOCs,在干旱條件下,植物可通過增加GLVs釋放量以抵御非生物脅迫(Loreto&Schnitzler,2010)。Morfopoulos等(2013)研究發(fā)現(xiàn)異戊二烯等單萜類和倍半萜烯可通過與活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)結合來抵御氧化性損傷,這種間接的化學防御能夠增強植物的適應性,從而迅速建立起重要的誘導防御系統(tǒng)。植物體內積累過量的ROS會誘導產生醛類化合物(周帥等,2012),植物葉片損傷誘導釋放大量的GLVs,被認為是評價植物受損的優(yōu)秀指標(Brillietal.,2011;Babu&Madhavan,2011)。GLVs中的C6醛異構體(E)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛含有α,β-不飽和的羰基,該羰基屬于活性親電基團,能誘導植物體內萜類揮發(fā)物的釋放、內源乙烯的生成及防御基因的表達,因此可調節(jié)植物的抗性反應(陳書霞等,2012;K?nnasteetal.,2013)。酸雨是一種非生物脅迫因素,植物是否也會通過釋放GLVs作為一種適應酸雨的機制,尚待驗證。毛竹(Phyllostachyspubescens)作為我國南方一種重要的森林資源,具有較高的社會、經濟和生態(tài)效益,在竹產業(yè)中具有重要地位。目前對毛竹的研究主要集中在毛竹生長(施擁軍等,2013)和選育(朱強根等,2013)等方面,關于酸雨對毛竹生理特性影響的研究較少。為進一步探討酸雨脅迫下毛竹葉片GLVs的釋放規(guī)律及對生化特性的影響,本試驗以毛竹為材料,人工模擬酸雨,利用動態(tài)頂空氣體循環(huán)法和熱脫附/氣相色譜/質譜聯(lián)用技術(TDC-GC-MS)測定毛竹葉片釋放GLVs成分的變化,同時測定毛竹葉片抗氧化酶活性的變化,以期從毛竹葉片釋放GLVs和生化角度揭示其對酸雨脅迫的適應機制,為毛竹經營和植物抗酸雨脅迫機理研究提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1栽植地與栽植試驗苗木為三年生毛竹實生苗,苗高約1m,于2013年4月移栽到高26cm、直徑35cm的花盆中,每盆1株,栽培土為紅壤。盆栽苗置于溫室中,緩苗期間用自來水澆灌,常規(guī)管理,光照條件為自然光。2013年6月選取長勢基本一致的盆栽苗20盆,隨機分為4組,每組5盆,進行人工酸雨噴施。1.2噴施濃硫酸和濃羧酸模擬酸雨的配制根據(jù)浙江省臨安市酸雨監(jiān)測分析資料,按照酸雨中SO42–:NO3–=4:1(摩爾比)的比例,用濃硫酸和濃硝酸配制母液,再用蒸餾水稀釋成pH值為2.5、4.0和5.6的酸液,對照用pH6.9的自來水噴施。根據(jù)臨安市常年月均降水量確定酸雨噴施量,每周噴施2次,每次每盆噴施100mL。1.3提取產物的酶活性測定酶液提取:稱取毛竹中上部成熟葉片0.2g,加入適量預冷的0.05mol·L–1、pH7.8的磷酸緩沖溶液,充分冰浴研磨后,定容至10mL?；靹蚝笤?℃下15000r·min–1離心20min?；厥丈锨逡褐苯佑糜诳寡趸富钚浴⒖扇苄缘鞍踪|和丙二醛(MDA)含量的測定。酶活性測定溫度為25℃。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定參照Giannopolitis和Riess(1977)的方法,以抑制NBT光氧化還原50%的酶量為一個酶活性單位U。過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性測定參照Chance和Maehy(1955)的方法,POD以時間掃描方式測定4min內吸光值的變化,取線性部分,計算每min吸光度變化值;CAT以3min內吸光度減少0.1的酶量為1個酶活性單位U?？扇苄缘鞍踪|含量測定參照Bradford(1976)的方法。MDA含量測定參照Zhang和Kirkham(1994)的方法。取上述酶提取液1mL,加入三氯乙酸和TBA混合液4mL,沸水中加熱15min,冰浴速冷,離心,取上清液于分光光度計中測定450、532和600nm處的吸光值,計算MDA含量。VOCs采集及分析方法:在9:00–11:00,采用QC-2型大氣采樣儀(北京市勞保所科技發(fā)展有限責任公司,北京)動態(tài)頂空氣體循環(huán)采集法收集毛竹葉片釋放的VOCs,首先用Reynolds微波爐袋(ReynoldsMetalsCompany,USA)從毛竹頂端套住并用膠帶固定,袋的上端插入一根出氣管,用膠帶扎緊,隨即用大氣采樣儀將經活性炭過濾的空氣通過進氣硅膠管充入袋內,使袋內氣體體積達到采樣袋體積的3/4,用硅膠管連接形成一個閉合回路,接通吸附管采集樣品氣體,氣體流量0.1m3·min–1,采樣時間30min。VOCs成分分析采用熱脫附/氣相色譜/質譜聯(lián)用技術(TDS-GC-MS)。儀器及參數(shù)設置條件參考Gao等(2005)的方法,TDS(TD3,GerstelGmbH&Co.KG,Mülheim,Germany)工作條件:載氣壓力為20kPa;進樣口溫度250℃,脫附溫度250℃(10min);冷阱溫度–100℃(保持3min);進樣時冷阱溫度驟然升至260℃。GC(7890A,AgilentTechnologiesCompany,SantaClara,USA)工作條件:色譜柱30m×250μm×0.25μmHP-5MS柱;程序升溫:初始溫度40℃,保持4min后,以6℃·min–1的速率升至250℃,保持3min后,以10℃·min–1的速率升至270℃,保持5min。MS(5975C,AgilentTechnologiesCompany,SantaClara,USA)工作條件:電離方式為EI;電子能量為70eV;質量范圍28–450aum;接口溫度280℃,離子源溫度為230℃,四級桿溫度150℃。1.4特征離子測定采用NIST2008譜庫檢索,并根據(jù)已報道的植物VOCs保留時間和特征離子對其各組分進行定性。VOCs定量方法:采用單位采樣時間內單株植物釋放出的VOCs特征離子峰面積進行定量。使用Oringin8.0和SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析及圖表制作,方差分析采用LSD法。2結果和分析2.1可溶性蛋白質含量酸雨脅迫初期,各處理可溶性蛋白質含量與對照無顯著差異(圖1)。隨著酸雨脅迫時間的延長,pH4.0和pH2.5處理蛋白質含量逐漸增加,均在處理45天時與對照差異達到極顯著水平,蛋白質含量分別是對照的1.32倍和1.65倍(p<0.01),隨后pH2.5處理可溶性蛋白質含量迅速減少,pH4.0處理仍增加且維持在較高水平。pH5.6處理可溶性蛋白質含量增加緩慢,且與對照差異不顯著。2.2mda含量測定酸雨脅迫對毛竹葉片MDA含量的影響見圖2。pH5.6處理MDA含量與對照無明顯差異。pH4.0和pH2.5處理隨脅迫時間延長,MDA含量均呈增加趨勢:pH4.0處理MDA含量增加緩慢,處理75天時MDA含量比對照增加了0.36倍(p<0.01),差異性極顯著;pH2.5處理使毛竹葉片MDA含量迅速增加,并且在第45天時達到極顯著水平(p<0.01),比對照增加了43%,之后繼續(xù)增加,脅迫60天和75天時pH2.5處理毛竹葉片MDA含量分別為對照的1.54倍和1.61倍(p<0.01)。2.3毛竹葉片pod活性由圖3A可以看出,pH5.6處理毛竹葉片SOD活性與對照無顯著差異。初期pH4.0和pH2.5處理SOD活性增加緩慢,處理15天時與對照無顯著差異,處理30天后pH2.5處理SOD活性迅速增強,45天時達到最大值,為對照的1.67倍(p<0.01),隨后其SOD活性迅速降低,在處理75天時SOD活性為對照的83.7%,差異極顯著(p<0.01);pH4.0處理于60天時SOD活性達到最大值,比對照增加52.7%,差異極顯著(p<0.01)。酸雨處理初期,毛竹葉片POD活性與對照無顯著差異(圖3B)。pH4.0處理POD活性增加緩慢,于處理75天時達到最大,比對照增加12.8%,差異顯著(p<0.05)。pH2.5酸雨處理使毛竹葉片POD活性迅速增強,并在處理30天時與對照差異顯著(p<0.05),在60天達到最大值,比對照提高了31.0%(p<0.01),隨后降低,但仍與對照差異極顯著。酸雨脅迫初期,pH4.0和pH2.5處理的毛竹葉片CAT活性與對照之間無顯著差異(圖3C),隨著脅迫時間延長,CAT活性逐漸增強,分別在第60天和第45天時達到最大值,CAT活性分別是對照的1.08倍和1.35倍(p<0.01),隨后毛竹葉片CAT活性降低。pH5.6處理毛竹葉片CAT活性與對照差異不顯著。2.4glvs的測定采用TDS/GC/MS對毛竹釋放的GLVs成分進行分析,不同酸雨脅迫處理下毛竹葉片GLVs釋放量及種類存在差異(表1)。隨著酸雨脅迫強度增加,毛竹葉片GLVs釋放量均呈增加趨勢,pH4.0和pH2.5處理分別比對照增加26.4%和132.9%,差異均達到極顯著水平(p<0.01)。pH5.6處理比對照增加了一種GLVs——(E)-2-辛烯醛,pH4.0處理比對照增加了2種GLVs,分別為(E)-2-辛烯醛和(E)-2-壬烯醛;pH2.5處理比對照增加3種GLVs,為(E)-2-己烯醛、2-乙基己醛和(E)-2-壬烯醛。pH2.5處理毛竹葉片釋放GLVs中含量最高的成分為癸醛,占其GLVs總量的24.7%,pH5.6和pH4.0處理釋放含量最高的GLVs均為2-乙基-1-己醇,分別占其GLVs總量的42.3%和44.5%。3免疫調節(jié)對毛竹葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響MDA是膜脂過氧化作用的最終分解產物,當酸雨脅迫超過植物自身可調節(jié)范圍時,植物細胞膜受損,質膜透性增加(孫業(yè)民等,2012),因此MDA含量高低可迅速反映出植物遭受逆境傷害的程度(Liu&Liu,2011)。本研究顯示毛竹葉片MDA含量隨pH值的降低而顯著增大(圖2),說明酸雨脅迫一段時間后,毛竹葉片細胞膜結構被破壞,超氧陰離子自由基代謝平衡被打破,高濃度酸雨處理的毛竹葉片超氧陰離子自由基產生速度超過了抗氧化酶的清除速度,導致MDA累積(王強等,2013)?？扇苄缘鞍踪|是植物體內的一種滲透調節(jié)物質,對緩解逆境對植物體的傷害有重要的調節(jié)作用(劉建福等,2013),酸雨脅迫下蛋白質含量增加(圖1),可能是由于酸雨脅迫使毛竹葉片刺激逆境蛋白大量合成,通過主動積累可溶性有機溶質,增加細胞滲透勢,維持細胞膨壓以保持正常代謝,從而提高植物的抗性,而長時間高濃度酸雨脅迫可溶性蛋白質含量降低,原因可能是酸雨破壞了植物逆境蛋白的合成機制(王麗華等,2013)。研究表明,隨著酸雨處理時間延長,植物葉片產生過量的ROS,SOD活性提高,催化超氧陰離子自由基歧化生成基態(tài)的分子氧和H2O2增多,POD和CAT活性隨之提高(趙棟等,2010),這與本研究酸雨處理的結果一致(圖3)。說明在酸雨脅迫初期,毛竹葉片啟動活性氧清除系統(tǒng)以維持活性氧的動態(tài)平衡(龍云等,2009;Kacharavaetal.,2013)。但隨著脅迫強度加劇和時間延長,毛竹葉片SOD活性迅速下降,表明歧化超氧陰離子的能力下降,CAT活性隨之下降,但POD活性保持穩(wěn)定來抵御脅迫,說明3種保護酶對酸雨脅迫的響應時間可能存在一些差異(劉芳等,2012;Chenetal.,2013)。酸雨脅迫下毛竹葉片抗氧化酶活性的變化趨勢表明,毛竹可以通過SOD、POD和CAT的協(xié)同作用在一定程度上降低自由基對植物體的傷害,因此SOD、POD和CAT的活性變化可作為研究酸雨對毛竹葉片膜系統(tǒng)影響的敏感指標。植物釋放GLVs是植物防御應答中的重要信號分子,Brilli等(2011)研究表明葉片損傷后植物釋放大量的醛類化