川北醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文開題報告表（2012版）論文題目FTY720對EAE小鼠NO/NOS、MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)影響研究生姓名譚書偉學(xué)號201102033導(dǎo)師姓名余巨明年級2011級攻讀學(xué)科專業(yè)神經(jīng)病學(xué)所屬院系臨床醫(yī)學(xué)系2013年6月15日學(xué)位論文開題報告內(nèi)容的基本要點(diǎn)1.所選課題目前的國內(nèi)外研究動態(tài)、水平；2.該領(lǐng)域內(nèi)存在和亟待解決的問題；3.所選課題的目的、意義；4.預(yù)期達(dá)到的結(jié)果、安排；5.進(jìn)行該課題所具備的條件；6.經(jīng)費(fèi)預(yù)算；7.進(jìn)行該課題的難點(diǎn)及其解決方法。一、立論依據(jù)（包括研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻(xiàn)及出處。）對基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢，論述本課題的科學(xué)意義；對應(yīng)用基礎(chǔ)研究著重結(jié)合學(xué)科前沿、圍繞國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展中的重要科技問題論述其應(yīng)用情景。多發(fā)性硬化(MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種廣泛脫髓鞘性自身免疫性疾病，可能是遺傳易感個體與環(huán)境因素作用而發(fā)生的自身免疫過程，由于其發(fā)病率較高,呈慢性病程和受累人群以中、青年居多,而且導(dǎo)致嚴(yán)重的功能殘障，而成為最重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。目前其病因和發(fā)病機(jī)制不清楚,治療手段也有限。因此，深入研究其發(fā)病機(jī)制及開拓新的治療方法，具有重要的臨床意義.近年來，用MOG誘導(dǎo)EAE已經(jīng)成為國際上研究MS的主要模型[1]。目前研究認(rèn)為MS發(fā)病與病毒感染、免疫失調(diào)、遺傳以及環(huán)境等多因素相關(guān)。本研究主要從免疫失調(diào)的角度剖析多發(fā)性硬化可能的發(fā)病機(jī)制，這是目前研究最多的。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，MS主要是由T細(xì)胞介導(dǎo)引起髓鞘、少突膠質(zhì)細(xì)胞、軸索的特異性損傷。遺傳與環(huán)境因素使得自身免疫性T細(xì)胞及抗體更容易通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。對s1p1(鞘氨醇1—磷酸鹽)受體研究發(fā)現(xiàn)，s1p1與T淋巴細(xì)胞遷移有很大關(guān)系[2]。FTY720是類似于s1p1的模擬體。從冬蟲夏草中提取，2010年經(jīng)FDA認(rèn)證，F(xiàn)TY720正式成為一種治療MS（主要是針對復(fù)發(fā)緩解型)的口服藥物[3]。FTY720本身并不被s1p1s識別，在體內(nèi)被神經(jīng)鞘氨醇激酶磷酸化為FTY720-p后,與淋巴細(xì)胞表面的s1p1s結(jié)合，使s1p1受體內(nèi)化和不敏感，從而抑制了T淋巴細(xì)胞從淋巴結(jié)遷移到外周組織中去,使中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘不受T淋巴細(xì)胞的攻擊[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)FTY720治療MS除了通過淋巴細(xì)胞上的s1p1途徑，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞S1P1也起了關(guān)鍵作用[5]。S1P1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞）表達(dá)。研究者通過基因工程技術(shù)將表達(dá)S1P1的基因從所有中樞神經(jīng)細(xì)胞組，神經(jīng)元細(xì)胞組和星型膠質(zhì)細(xì)胞組上分別敲除，用FTY720進(jìn)行干預(yù)，幾組中外周淋巴細(xì)胞變化水平并沒有什么區(qū)別。如果FTY720只通過了淋巴細(xì)胞途徑，那么在S1P1基因缺失的所有EAE小鼠中癥狀都應(yīng)緩解。然而，實驗中并沒有觀察到這一現(xiàn)象。只在S1P1基因缺失的神經(jīng)元組中臨床癥狀明顯緩解，而在S1P1基因缺失的星型膠質(zhì)細(xì)胞組沒有緩解，說明FTY720對MS的治療作用必須通過星形膠質(zhì)細(xì)胞S1P1受體途徑。Steinman等學(xué)者通過對MS大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)多發(fā)性硬化損傷依據(jù)疾病的活動水平呈現(xiàn)不同的特點(diǎn)。研究者應(yīng)用激光捕獲顯微切割和質(zhì)譜分析法發(fā)現(xiàn)慢性活動性損傷（CAP）中5種參與凝血級聯(lián)反應(yīng)的蛋白[6]。這證實了凝血因子在多發(fā)性硬化免疫系統(tǒng)失調(diào)中具有不容置疑的作用。研究者將注意力集中在了其中的2種蛋白：凝血激酶和蛋白C抑制劑(PCI)。研究者將實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)小鼠（EAE小鼠常用于多發(fā)性硬化造模）分成生理鹽水組，水蛭素組和重組激活蛋白C(aPC)組，每天注射相同劑量。實驗發(fā)現(xiàn)：治療35d后，免疫細(xì)胞增殖力下降,脾細(xì)胞及淋巴結(jié)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子減少，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥反應(yīng)灶的數(shù)量也降低了。水蛭素組和aPC組都能有效減輕EAE癥狀，從而認(rèn)為凝血因子參與了MS的發(fā)病。以上的研究表明s1p1在淋巴細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，并起了關(guān)鍵作用，以前認(rèn)為s1p1是鞘磷脂的第二信使衍生物，調(diào)節(jié)幾種細(xì)胞骨架反應(yīng):包括增殖、遷移和細(xì)胞存活[7].2012年HideruObinata和TimothyHla學(xué)者在NIH上做了關(guān)于s1p的研究表明：s1p受體不同的亞型在人體內(nèi)不同程度地表達(dá)(如免疫系統(tǒng)、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等)。s1p受體5個亞型中S1P1是關(guān)注的焦點(diǎn)，S1P1作為主要受體在淋巴細(xì)胞，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞等上表達(dá)并廣泛參與人體病理生理過程[8].其中發(fā)現(xiàn)S1P1信號傳導(dǎo)通路參與了凝血過程[9]。FTY720必須通過星形膠質(zhì)細(xì)胞S1P1對MS起作用。凝血酶抑制劑水蛭素通過凝血途徑對MS起作用，而s1p1又參與了凝血途徑，那么水蛭素是否通過調(diào)節(jié)s1p1受體起到治療MS的作用，查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)沒有報道。因此，我們擬就“水蛭素對EAE模型星形膠質(zhì)細(xì)胞S1P1受體的影響”進(jìn)行研究。如果水蛭素能通過調(diào)節(jié)s1p1受體起到治療MS的作用，那么就為水蛭素在治療MS中的臨床運(yùn)用提供新的理論和實驗依據(jù)。參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)[1]StefanieK,SitaJ,MagdalenaT,etal.FundamentaldifferencesinthedynamicsofCNSlesiondevelopmentandcompositioninMP4-andMOGpeptide35?55?induced[2]CzelothN,BernhardtG,HofmannF,GenthH,F?rsterR.Sphingosine-1-phosphatemediatesmigrationofmaturedendriticcells.JImmunol.2005;175:2960–2967.[3] ObinataH,HlaT.Sphingosine1-phosphateincoagulationandinflammation[J].SeminImmunopathol,2012,34(1):73-91.[4] O'BrienK,GranB,RostamiA.T-cellbasedimmunotherapyinexperimentalautoimmuneencephalomyelitisandmultiplesclerosis[J].Immunotherapy,2010,2(1):99-115.[5] ChoiJW,GardellSE,HerrDR,etal.FTY720(fingolimod)efficacyinananimalmodelofmultiplesclerosisrequiresastrocytesphingosine1-phosphatereceptor1(S1P1)modulation[J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(2):751-756.[6] HanMH,HwangSI,RoyDB,etal.Proteomicanalysisofactivemultiplesclerosislesionsrevealstherapeutictargets[J].Nature,2008,451(7182):1076-1081.[7]SpiegelS，MilstienS.Exogenousandintracellularlygeneratedsphingosine1－phosphatecanregulatecellularprocessesbydivergentpathways［J］.BiochemSocTrans，2003，31(Pt6):1216－1219．[8] HlaT,VenkataramanK,MichaudJ.ThevascularS1Pgradient-cellularsourcesandbiologicalsignificance[J].BiochimBiophysActa,2008,1781(9):477-482.[9] TakeyaH,GabazzaEC,AokiS,etal.Synergisticeffectofsphingosine1-phosphateonthrombin-inducedtissuefactorexpressioninendothelialcells[J].Blood,2003,102(5):1693-1700.

二、研究方案1.研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)：研究重組水蛭素對EAE模型星形膠質(zhì)細(xì)胞s1p1表達(dá)的影響情況。以探討重組水蛭素是否通過了s1p1受體途徑治療EAE研究內(nèi)容：1.通過免疫熒光雙標(biāo)的方式標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞和s1p1受體2.同時測定s1p1受體的基因表達(dá)情況。擬解決的關(guān)鍵問題：FTY720必須通過星形膠質(zhì)細(xì)胞S1P1對MS起作用。凝血酶抑制劑水蛭素通過凝血途徑對MS起作用，而s1p1又參與了凝血途徑，那么水蛭素是否通過調(diào)節(jié)s1p1受體起到治療MS的作用，查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)沒有報道。因此，我們擬就“水蛭素對EAE模型星形膠質(zhì)細(xì)胞S1P1受體的影響”進(jìn)行研究。如果水蛭素能通過調(diào)節(jié)s1p1受體起到治療MS的作用，那么就為水蛭素在治療MS中的臨床運(yùn)用提供新的理論和實驗依據(jù)。2.擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析1.研究對象分組：生理鹽水干預(yù)組，重組水蛭素干預(yù)組，正常組2.建立EAE動物模型，3.腦組織組織取材及制備藥物干預(yù)后取腦和脊髓標(biāo)本做冰凍切片，進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)；一部份置于液氮中保存，進(jìn)行RT-PCR檢測。4.腦組織是s1p1受體mRNA的檢測取腦組織100mg勻漿，提取總RNA,采用熒光定量PCR檢測腦組織s1p1受mRNA表達(dá)情況。可行性分析1.本課題立項是基于川北醫(yī)學(xué)院具備基礎(chǔ)研究的條件和設(shè)施。2.導(dǎo)師及指導(dǎo)老師在這方面具有扎實的理論基礎(chǔ)和豐富的經(jīng)驗。3.方案實施和技術(shù)路線的確定是經(jīng)過多方面查閱文獻(xiàn)資料，并結(jié)合實際情況后得出,具有一定的科學(xué)性和可操作性。4.川北醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計學(xué)教研室?guī)熧Y力量雄厚，可以提供準(zhǔn)確可靠的統(tǒng)計學(xué)幫助。雌性C57BL/6雌性C57BL/6小鼠正常組（不含MOG正常組（不含MOG的弗氏佐劑）水蛭素干預(yù)組（含MOG的弗氏佐劑)生理鹽水干預(yù)組（含MOG的弗氏佐劑)技術(shù)路線12天后對12天后對EAE發(fā)病評分取腦和脊髓標(biāo)本（發(fā)病后30天）進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)RT-PCR測定s1p1RT-PCR測定s1p1受體基因表達(dá)GAFP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞GFP標(biāo)記s1p1受體GAFP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞GFP標(biāo)記s1p1受體3.本課題的創(chuàng)新之處本課題的創(chuàng)新之處是試圖探討：“水蛭素對EAE的治療作用是否通過了星形膠質(zhì)細(xì)胞s1p1受體途徑”,從而為水蛭素等凝血酶抑制劑的臨床應(yīng)用開辟新的途徑。4.研究計劃及預(yù)測進(jìn)展本研究預(yù)期共需1年，研究進(jìn)度和目標(biāo)安排如下：2013.1-2014.31.查閱資料及實驗室試劑和器材的準(zhǔn)備工作。2.建立EAE動物模型3.藥物干預(yù)后取腦標(biāo)本，到病理科行冰凍切片，然后免疫熒光雙標(biāo)4.測腦標(biāo)本s1p1受體基因表達(dá)5.整理資料、撰寫論文，結(jié)題。5.預(yù)期研究成果通過本研究如能發(fā)現(xiàn)重組水蛭素干預(yù)組s1p1受體表達(dá)較正常對照組明顯增加。結(jié)論如與我們先前的動物實驗一致，從而為水蛭素等凝血酶抑制劑對EAE治療作用開辟新的臨床途徑。

本研究擬在國內(nèi)外核心期刊上發(fā)表有關(guān)研究結(jié)果的論文1－2篇。三、研究基礎(chǔ)1.與本課題有關(guān)的，前期研究工作積累和已取得的研究工作成績。發(fā)表在NIH上的研究發(fā)現(xiàn)FTY720治療MS除了通過淋巴細(xì)胞上的s1p1途徑，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞S1P1也起了關(guān)鍵作用。S1P1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞）表達(dá)。研究者通過基因工程技術(shù)將表達(dá)S1P1的基因從所有中樞神經(jīng)細(xì)胞組，神經(jīng)元細(xì)胞組和星型膠質(zhì)細(xì)胞組上分別敲除，用FTY720進(jìn)行干預(yù)，證明了FTY720對MS的治療作用必須通過星形膠質(zhì)細(xì)胞S1P1受體途徑。發(fā)表在Nature上的一項研究通過對MS大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)多發(fā)性硬化損傷依據(jù)疾病的活動水平呈現(xiàn)不同的特點(diǎn)。研究者應(yīng)用激光捕獲顯微切割和質(zhì)譜分析法發(fā)現(xiàn)慢性活動性損傷（CAP）中5種參與凝血級聯(lián)反應(yīng)的蛋白。用水蛭素干預(yù)能有效減輕EAE癥狀，從而認(rèn)為凝血因子參與了MS的發(fā)病。2.已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑（包括利用其他實驗室和開放實驗室的計劃與落實情況）。實驗室設(shè)備及設(shè)備條件：本院的動物實驗中心，風(fēng)濕免疫研究所、病理科具有完善的設(shè)備。包括：電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白定量儀、酶標(biāo)分析儀、倒置顯微鏡、低溫離心機(jī)、超凈臺、恒溫培育箱、冰凍切片機(jī)、及CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱等設(shè)備可供本項目研究使用。實驗所需的各種藥盒及試劑均能購買。本研究所依托的學(xué)校和醫(yī)院具有豐富的館藏文獻(xiàn)和專業(yè)的中英文全文數(shù)據(jù)庫，能提供及時全面的文獻(xiàn)資料，保障實驗的順利進(jìn)行。能成功建立EAE小鼠模型，熟練掌握了病理切片、RT-PCR、熒光雙標(biāo)等技術(shù)和方法。3.近期已發(fā)表與本課題有關(guān)的主要論著目錄。序號作者題目發(fā)表或投稿刊1LawrenceSteinmanProteomicanalysisofactivemultipleNaturesclerosislesionsrevealstherapeutictargets2JiWoongChoiFTY720(fingolimod)efficacyinananima