超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展

超氧化物（sod）廣泛存在于各種生物體中，可以加速身體中的超氧自由基（o2-）的異質(zhì)反應(yīng)。它是體內(nèi)的一種天然洗劑，可以保護(hù)身體的細(xì)胞。因此,機(jī)體內(nèi)SOD在防御O2-的毒性、抗衰老以及預(yù)防腫瘤和抗炎等方面起著重要的生理作用。受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥日用化工,食品及生化界的極大關(guān)注。在我國(guó),SOD研究和應(yīng)用的深度及廣度已居酶類(lèi)生化制劑的首位。1sod的類(lèi)型和理化性質(zhì)1.1等固體內(nèi)分離的sod迄今為止,人們已從細(xì)菌、真菌、原生植物、藻類(lèi)、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物等生物體內(nèi)分離得到了SOD。按其金屬輔助基的不同,可分為Cu、Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三種類(lèi)型。后兩者性質(zhì)相似,在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)、分子量、光譜性質(zhì)及對(duì)不同抑制劑的敏感等方面與前者差別較大。1.2od的理化性質(zhì)SOD是一種酸性蛋白,在酶分子上共價(jià)連結(jié)金屬輔助基,因此它對(duì)熱,PH以及某些理化性質(zhì)表現(xiàn)出異常的穩(wěn)定性,SOD的主要理化性質(zhì)見(jiàn)表1。以上討論了三種不同SOD的種類(lèi)分布及理化性質(zhì),可以看出,這三種SOD都可以催化O2-歧化為H2O2和O2,但SOD與一般酶不同之處在于其作用底物是一種壽命很短的自由基O2-,這給SOD的催化機(jī)理和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究等主要實(shí)驗(yàn)方法中取得相互一致的結(jié)果。但是,徹底闡明SOD的催化機(jī)制還尚待進(jìn)一步研究。2sod活性測(cè)定2.1鄰苯三酚分光光度法原理:在堿性條件下,鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng),并產(chǎn)生O2-,在SOD存在下,自氧化反應(yīng)受到抑制。測(cè)定方法:鄰苯三酚發(fā)生自氧化測(cè)定:50mM的Tris-HCl(PH=8.2)緩沖液3ml,預(yù)熱至25℃,加入10μl50mM的鄰苯三酚,充分搖勻,以緩沖液做空白對(duì)照,每隔半分鐘測(cè)一次吸光度。同樣條件,加入10μl待測(cè)SOD液,讀取其吸光度。該法所用試劑和儀器比較普通,測(cè)試方便,靈敏度高,是目前應(yīng)用最廣泛的一種測(cè)試方法,但對(duì)溫度、PH、鄰苯三酚濃度、SOD待測(cè)液存放時(shí)間等諸因素比較敏感,因此測(cè)定時(shí)要嚴(yán)格控制這些因素。2.2sod的活性原理:鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-與羥胺反應(yīng)生成亞硝酸鹽,在酸性條件下,亞硝酸鹽與氨基苯磺酸和N-甲萘基二氨基乙烯反應(yīng)生成紅色化合物,而SOD抑制此反應(yīng),根據(jù)抑制率高低計(jì)算活性。測(cè)定方法:將10mM鄰苯三酚,10mMEDTA-Na2,40mM鹽酸羥胺和重蒸水按1:1:4:4配制反應(yīng)液,將90mg/dl氨基苯磺酸和1.5mg/dlN-甲萘基二氨基乙烯按1:1配成顯色液,取0.95ml0.1M的Tris-HCl和0.05mlSOD待測(cè)液,再加0.1ml反應(yīng)液,室溫反應(yīng)15min,再加2.0ml顯色液,550nm比色。2.3細(xì)胞色素c還原反應(yīng)速率原理:在有氧的條件下,黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤發(fā)生氧化反應(yīng)生成尿酸,與此同時(shí)產(chǎn)生O2-,O2-氧化型細(xì)胞色素C還原為還原型細(xì)胞色素C,后者在550nm處有最大吸收。存在SOD時(shí),O2-被催化而歧化,細(xì)胞色素C還原反應(yīng)速率則降低。根據(jù)細(xì)胞色素C在加入SOD前后被O2-還原的速率變化測(cè)定SOD活性。測(cè)定方法:PH7.8,0.3M磷酸鉀緩沖液0.5ml(含0.6mlEDTA),6×10-5M氧化型細(xì)胞色素C液0.5ml,0.3mM黃嘌呤液0.5ml,1.3ml重蒸水,在預(yù)保溫10分鐘,最后加入1.7×10-3u/mg.port的黃嘌呤氧化酶0.2ml,并立即計(jì)時(shí),速率變化在2分鐘內(nèi)有效,控制黃嘌呤氧化酶濃度,使其在550nm的吸光度為0.25/min,測(cè)定SOD活性時(shí),加入0.3mlSOD被測(cè)液,重蒸水相應(yīng)減少到1.0ml,根據(jù)抑制程度,計(jì)算活性。2.4sod活性的測(cè)定原理:黃嘌呤氧化酶在有氧的條件下,催化黃嘌呤或次黃嘌呤生成尿酸和O2-,進(jìn)一步與化學(xué)發(fā)光劑魯米諾(Luminol)或?，摤摴馑卣T導(dǎo)劑(CLA)反應(yīng),使發(fā)光劑受到激發(fā)成為激發(fā)態(tài),當(dāng)它返基態(tài)時(shí)就向外發(fā)光即化學(xué)發(fā)光,根據(jù)抑制程度可測(cè)得SOD的活性。測(cè)定方法:在25℃,各管中先加入PH5.6磷酸鹽緩沖液0.6ml,1mMEDTA-Na2溶液0.1ml,1mM黃嘌呤溶液0.1ml,5μm的CLA測(cè)試管中再加10μl待測(cè)樣本(對(duì)照管中加入10μl生理鹽水,放入發(fā)光儀測(cè)試室),最后加入100μl黃嘌呤氧化酶應(yīng)用液,啟動(dòng)反應(yīng)。該法具有時(shí)間響應(yīng)快、分析精確、靈敏度高、專(zhuān)一性強(qiáng)、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn),但需要高靈敏度的精密發(fā)光測(cè)量?jī)x器。此外,SOD活性的測(cè)定方法還有氮藍(lán)四唑(NBT)改良法、極譜氧電極法、堿性二甲基亞砜法、堿性連二亞硫酸鈉法、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法等。3sod的使用3.1sed藥物的使用SOD的藥用研究,國(guó)內(nèi)外主要用于治療因超氧陰離子傷害引起的疾病如心肌缺血與缺血再灌注綜合癥、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等。3.1.1o2-與臨床表現(xiàn)心肌缺血與缺血再灌注損傷是當(dāng)今十分活躍的研究領(lǐng)域,它揭示了過(guò)去某些臨床難以解釋的疾病矛盾,例如在冠狀動(dòng)脈的搭橋手術(shù)、溶栓術(shù)、變異型心絞痛及冠狀動(dòng)脈痙攣緩解再時(shí)導(dǎo)致的病情惡化等均與O2-存在密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明,心肌缺血再灌注損傷過(guò)程O(píng)2-產(chǎn)生增加,O2-通過(guò)膜的脂質(zhì)氧化損傷心肌細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和溶酶體膜,從而破壞了機(jī)體的正常代謝。如果在這個(gè)時(shí)候注射適量的SOD便可有效防治“綜合癥”出現(xiàn)。SOD除應(yīng)用于心臟和小腸動(dòng)脈缺血再灌注外,也可應(yīng)用于肝、腎、心臟等器官的保存和移植,斷肢再植,整形美容等手術(shù)過(guò)程。3.1.2抗氧化氧自由基炎癥是機(jī)體受到外界微生物入侵后的一種保護(hù)性反應(yīng)。吞噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中起著重要作用,它們?cè)谕淌蛇^(guò)程或受剌激產(chǎn)生呼吸爆發(fā),消耗氧氣,釋放大量活性氧自由基,如O2-和羥基自由基(·OH),從而直接毒害真核細(xì)胞,損傷內(nèi)皮細(xì)胞,紅細(xì)胞,成纖維細(xì)胞,血小板和精子,白細(xì)胞本身也能被它自己產(chǎn)生的氧自由基損傷。用SOD治療角叉菜膠誘導(dǎo)的胸膜炎,可減少胸腔積液和白細(xì)胞的積累。SOD還可以抑制關(guān)節(jié)炎,干擾白細(xì)胞在腎小球炎癥部位的積累。SOD可以抑制黃嘌呤氧化酶引起的急性氣管炎導(dǎo)致的器官通透性的改變,減少多形核白細(xì)胞在肺部的積累。由此可見(jiàn),SOD用于治療炎癥具有很好的應(yīng)用前景。3.1.3慢性發(fā)病過(guò)程動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)SOD和其它氧自由基的清除劑能抑制自身免疫性疾病的慢性發(fā)病過(guò)程。研究表明:人類(lèi)紅斑性狼瘡患者血清中有一種能使染色體破壞的介裂因子,這種因子的存在與O2-出現(xiàn)息息相關(guān),類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人血液中SOD活性比正常人低得多,故上述兩種病人均可用SOD治療。3.2超氧物歧化酶在新鮮和加工的食品中,往往存在有超氧自由基(O2-)。這些超氧自由基能迅速氧化諸如抗壞血酸、α-生育酚之類(lèi)的重要營(yíng)養(yǎng)組分。對(duì)哺乳動(dòng)物源中SOD的研究表明,SOD對(duì)乳本身起到抗氧化的作用,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在牛乳中SOD在71.7℃下經(jīng)15s后,仍對(duì)巴氏消毒作用有抵抗作用,SOD能除去誘發(fā)脂類(lèi)過(guò)氧化作用的超氧自由基,從而達(dá)到防止牛乳敗壞的目的。實(shí)驗(yàn)表明,超氧自由基可能是引起異味和變色化合物的潛在的前體,這些化合物在某些條件下經(jīng)過(guò)氧化酶的氧化作用而形成。過(guò)氧化酶活性通常被人們認(rèn)為對(duì)植物性食物的品質(zhì)有害,SOD對(duì)防止由于過(guò)氧化酶活性而引起質(zhì)量降低有一定的作用。脂肪過(guò)氧化反應(yīng)可以通過(guò)黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生O2-或通過(guò)脂氧化酶來(lái)誘發(fā),但存在SOD時(shí)則被抑制,已發(fā)現(xiàn)鱭油自動(dòng)氧化作用由于SOD的存在而延緩。由上述可以看出,超氧物歧化酶是一種可能作為食品天然抗氧化劑的酶。目前超氧物歧化酶已被申請(qǐng)專(zhuān)利作為食品中抗氧化劑。國(guó)外把SOD作為食品添加劑的例子是加在口香糖和飲料中。我國(guó)貴州農(nóng)學(xué)院已開(kāi)發(fā)出刺梨SOD飲料。3.3sod化妝品據(jù)悉,國(guó)外不少高級(jí)化妝品中都添加SOD,國(guó)內(nèi)也有數(shù)家工廠或公司在開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)SOD化妝品,如大寶SOD蜜、康妮SOD、SOD康舒達(dá)霜?jiǎng)┑?。?dāng)然,至今仍有人對(duì)SOD能否透過(guò)皮膚及其實(shí)際效果持懷疑態(tài)度,對(duì)這些問(wèn)題還待于進(jìn)一步研究。3.4sod與植物的心理特性近年來(lái)有不少學(xué)者對(duì)SOD逆境生理關(guān)系進(jìn)行廣泛研究,當(dāng)植物處于逆境時(shí),植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基,從而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育,只有當(dāng)植物體內(nèi)產(chǎn)生適量的SOD,才能清除O2-對(duì)其的毒害作用。由此可見(jiàn),開(kāi)展SOD與植物逆境生理關(guān)系的研究,不但有助于植物在逆境中的生理化關(guān)系,而且可培育出抗逆性強(qiáng),有經(jīng)濟(jì)效益的新品種。在應(yīng)用研究上,SOD也被作為選擇性殺傷癌細(xì)胞的標(biāo)靶,通過(guò)破壞癌細(xì)胞SOD活性,使癌細(xì)胞喪失對(duì)毒性氧的防御能力,致使癌細(xì)胞凋亡。另外用基因工程技術(shù)制備的重組SOD已廣泛用于應(yīng)用研究以及與應(yīng)用直接相關(guān)的基礎(chǔ)理論研究。4植物藥中sod基因的克隆與表達(dá)國(guó)外對(duì)SOD進(jìn)行了一系列的基礎(chǔ)應(yīng)用開(kāi)