植物抗凍蛋白在冷凍食品中的應用

抗凍蛋白（afp）或冰結蛋白是抑制晶體生長和重結晶的蛋白質(zhì)。它可以以非離幾性形式減少溶液的結晶，并對其分解幾乎沒有影響。由于這種分解和結晶之間的差異稱為熱態(tài)活性，而抗凍蛋白也被稱為熱態(tài)蛋白?？箖龅鞍卓赏ㄟ^直接混合、浸泡、真空滲透等物理手段,添加到冰淇淋、冷凍肉制品和冷凍面團等食品中,來減少冰晶形成和重結晶對冷凍食品質(zhì)構的破壞,改善冷凍食品的品質(zhì)與性能,延長貨架期[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11]?？箖龅鞍自谥参铩⒑Ｑ篝~類、昆蟲和微生物中均有分布,而植物抗凍蛋白最容易為食品生產(chǎn)企業(yè)和一般消費者所接受,其來源也比較廣泛易得。因此,關于抗凍蛋白的商業(yè)利用和研究就集中到植物來源的分離上。研究發(fā)現(xiàn),植物抗凍蛋白的熱滯活性比魚類和昆蟲抗凍蛋白的熱滯活性低,但植物抗凍蛋白有高的重結晶抑制功能。目前,多種植物抗凍蛋白已被分離純化和表征,包括冬黑麥(SecalecerealeL.)、胡蘿卜(Daucuscarota)、冬小麥(Triticumaestivum)、沙冬青(Ammopiptanthusmongolicusere)、女真葉(Ligustrumlucidum)、連翹等。對多種植物抗凍蛋白的分析結果表明,不同來源的抗凍蛋白的多肽結構有明顯區(qū)別,有些含有糖配基,有些則不含有糖配基。鑒于抗凍蛋白在冷凍食品工業(yè)領域具有的廣闊應用前景,GB2760-2011已將其列為可用于冷凍食品中的新型食品添加劑。因此,對植物抗凍蛋白進行高效分離純化的方法亟待研究。作者擬對目前植物抗凍蛋白的分離純化方法進行歸納,并對存在的優(yōu)缺點進行分析,以期為未來抗凍蛋白分離技術的發(fā)展提供一定的參考。1柱凈化+膜濃縮法分離抗凍蛋白傳統(tǒng)從冷帶植物中分離抗凍蛋白的步驟一般包括植物原料均漿、離心、硫酸銨或乙醇分級沉淀、超濾、脫鹽、上離子交換柱、梯度洗脫、過凝膠過濾層析柱、濃縮、冷凍干燥等步驟。例如,Kontogiorgos等將冷誘導的冬小麥草非原質(zhì)體提取物經(jīng)過熱處理、超濾膜濃縮、乙醇分級沉淀和體積排阻色譜等步驟,獲得了一種熱穩(wěn)定的抗凍蛋白,并研究了其對冷凍面團超微結構的影響。尉姍姍等將新疆沙冬青葉片配合液氮用攪拌機打磨至粉狀,加入緩沖液混勻,高速離心,取上清液后超濾脫脂;然后,將脫脂后的樣品,用美國Bio-Rad公司的雙流速層析系統(tǒng)進行DE-52離子交換柱進行層析分離,NaCl梯度洗脫后收集各洗脫峰;最后經(jīng)脫鹽、冷凍干燥,得到相對分子質(zhì)量為11924的抗凍蛋白。Simpson等將連翹的蛋白質(zhì)提取液依次經(jīng)過陰離子交換柱、羥基磷灰石色譜和凝膠過濾進行分離純化,獲得了一種相對分子質(zhì)量為20000的抗凍蛋白。王維香等將沙冬青提取液依次經(jīng)過熱處理、弱陰離子交換層析(DEAE-celluloseA52)、凝膠過濾層析(SephacrylS300)、疏水高效液相層析(Poros20HP2)和強陰離子高效液相交換層析(Sourcel5Q),分離純化到抗凍蛋白amAFP28。傳統(tǒng)層析方法存在分離周期長、過程繁瑣、得率低、分離工藝不穩(wěn)定和重復性差等缺點,并且在大規(guī)模生產(chǎn)中,由于耗資昂貴不能使產(chǎn)品維持合理的價格。另外,利用硫酸銨或乙醇分級沉淀法來純化抗凍蛋白,硫酸銨或乙醇可能會改變活性潛伏的蛋白質(zhì)二級結構,造成抗凍活性的損失。2sds-東南角電泳SDS電泳分離方法是將具有熱滯活性的抗凍蛋白的電泳條帶進行切割分離,該方法步驟少、時間短,適用于高精度和高純度抗凍蛋白樣品純化。Hon等對冬黑麥非質(zhì)體提取液進行SDS電泳,然后直接回收凝膠上的抗凍蛋白。Wang等則首先采用經(jīng)典的蛋白質(zhì)色譜技術來分離沙冬青葉片中的抗凍蛋白質(zhì),然后經(jīng)非變性PAGE膠分離、回收,得到具有熱滯活性的抗凍蛋白的條帶。Zhang等則采用SDS電泳電泳條帶切割法與柱層析分離相結合的方法獲得了冬小麥麩皮抗凍蛋白。然而,SDS電泳分離過程中,電泳分離的各峰間相互疊加,分離效率不太理想,并且分離過程有時會發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀,使收集電泳組分困難。另外,該方法必須在有標準樣品的基礎上才可以有效地純化,純化的樣品也非常少。3沙棘抗凍蛋白的純化與冰、鹽的組合目前,利用抗凍蛋白對親水性表面具有自發(fā)的親和吸附能力,開發(fā)和制備新型的吸附分離介質(zhì)開始受到關注。例如,Kuiper等根據(jù)抗凍蛋白和冰晶之間存在特異吸附性,設計了一個“冷手指(ColdFinger)”(圖1)。樣品置于燒杯中,緩慢的磁力攪拌,保證溶液體系均勻,“冷手指”通過與其相連的管路控制溫度。該“冷手指”可以從粗提物中純化與冰結合的抗凍蛋白,使用一次就使抗凍蛋白濃度提高50倍,操作效率高。Zhang等參照Kuiper的試驗方法,并對分離裝置進行了改良(圖2)。首先通過熱重分析儀法和分配系數(shù)法研究證明冬小麥麩皮抗凍蛋白具有較強的親水性和親冰性,然后使用冰特異性親和吸附法對其純化,獲得了產(chǎn)率為1.64%的電泳純小麥麩皮抗凍蛋白。劉尚等根據(jù)抗凍蛋白與冰結合的特性,利用碎冰從女貞葉提取液中分離出抗凍蛋白。結果表明,通過碎冰吸附、凝膠過濾和離子交換層析可以獲得4個組分的蛋白質(zhì),經(jīng)過差式掃描量熱儀鑒定,其中的1個具有熱滯活性。Gupta等也使用類似的方法來分離沙棘中的抗凍蛋白。首先通過二維電泳、質(zhì)譜和冰晶修飾活性鑒定出沙棘提取液中含有抗凍蛋白,進而通過冰特異性親和吸附法對沙棘抗凍蛋白進行了制備純化(圖3)。冰特異性吸附分離法利用了抗凍蛋白對冰的特異吸附性,經(jīng)一步分離步驟即可使植物抗凍蛋白的純化倍數(shù)顯著提高,比傳統(tǒng)的色譜方法更加快捷高效;但是該方法對純化過程的控制要求嚴格,目前的分離裝置還比較復雜。隨著蛋白質(zhì)分離純化設備的發(fā)展與改進,該方法具有廣闊的應用前景。4濁點萃取純化抗凍蛋白濁點萃取(Cloud-PointExtraction,CPE)是近年來在分離科學領域備受關注的一種新穎分離方法,它不使用揮發(fā)性有機溶劑,不影響環(huán)境。它利用非離子表面活性劑水溶液在加熱到濁點溫度時形成界面清晰的膠束/水兩相(圖4),而組分可在兩相中進行分配來實現(xiàn)分離。濁點系統(tǒng)可基于包括脂肪酸聚氧乙烯醚和烷基酚聚氧乙烯醚系列,以及烷氧基嵌段共聚物類化合物等。CPE法具有經(jīng)濟、安全、高效、操作簡便、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。作者首次將濁點萃取法用于冬小麥抗凍蛋白的分離純化。首先采用含非離子表面活性劑的緩沖溶液從冬小麥和女真葉中的浸取抗凍蛋白;然后加熱到濁點溫度后分成水相和膠束相兩相,疏水性雜質(zhì)富集于膠束相,而親水性的抗凍保留在水相;最后經(jīng)透析濃縮、冷凍干燥得到純化的抗凍蛋白產(chǎn)品。應用SDS和差示掃描量熱儀(DSC)分別測定了其相對分子質(zhì)量范圍和熱滯活性值?？箖龅鞍紫鄬Ψ肿淤|(zhì)量范圍為20200～66100,熱滯活性范圍為0.20～0.38℃,濁點萃取過程對抗凍蛋白的熱滯活性不產(chǎn)生顯著影響。抗凍蛋白由于具有很強的親水性將保留在水相,而疏水性雜質(zhì)選擇性地萃取到膠束相,這是濁點萃取純化抗凍蛋白的基礎。另外,還研究了凈電荷、相對分子質(zhì)量不同的女貞葉抗凍蛋白在SDS/TritonX-114雙水相系統(tǒng)的的分配行為。其分配行為受膠束與抗凍蛋白的體積排阻作用而影響,而蛋白凈電荷作用對其分配無顯著影響。抗凍蛋白的分配系數(shù)與蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、SDS質(zhì)量濃度和溫度呈正相關性,其值在1.56～9.51之間;隨著SDS質(zhì)量濃度和溫度的增加,表面活性劑聚集體的尺寸增加,膠束相對抗凍蛋白的體積排阻增強,進而促進其相水相轉(zhuǎn)移。以上研究結果表明:濁點萃取法的表面活性劑用量少、成本低、體系組成簡單,是一種極具潛力的抗凍蛋白分離方法。5抗凍蛋白分離方法的發(fā)展方向目前,大多數(shù)研究重點均集中在新抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)及分析上,而對其分離制備過程的關鍵技術則研究較少。另外,抗凍蛋白的分離純化方法研究主要還局限在實驗室分析規(guī)模,將其發(fā)展到對抗凍蛋白的大規(guī)模分離純化還面臨著許多問題和挑戰(zhàn)。例如,如何篩選出對抗凍蛋白具有特異性作用的功能基團,抗凍蛋白與分離介質(zhì)間如何相互作用、怎樣匹配,等等。因此,有必要對這些科學問題進行系統(tǒng)深入的基礎研究,揭示其內(nèi)在的科學規(guī)律和