殼聚糖季銨鹽的合成及其抗菌性的研究

殼聚糖是一種環(huán)保新材料。它資源豐富，無(wú)污染，污染。具有良好的生物適應(yīng)性和生物可分解性，開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。殼聚糖具有廣譜抗菌性,已被應(yīng)用到織物的抗菌整理中。盡管如此,因其在pH大于6.5時(shí)很難溶解,限制了它的應(yīng)用。為了提高棉織品的抗菌保健功能,人們對(duì)殼聚糖進(jìn)行了各種化學(xué)改性,得到了無(wú)毒的水溶性殼聚糖衍生物。Kim等報(bào)道了通過(guò)硼氫化鈉等先合成席夫堿,再與碘甲烷、氫氧化鈉合成碘化三甲基殼聚糖季銨鹽。Qin把縮水甘油三甲基氯化銨和殼聚糖合成殼聚糖羥丙基三甲基氯化銨,并做了抗菌實(shí)驗(yàn)。但上述實(shí)驗(yàn)合成路線復(fù)雜、成本高。殼聚糖與碘甲烷、氫氧化鈉直接合成三甲基殼聚糖季銨鹽的報(bào)道及其抗菌性的研究工作卻很少。本研究改進(jìn)了殼聚糖季銨鹽的合成方法,并研究了碘化N-三甲基殼聚糖季銨鹽的抗菌性能,獲得了良好的抗菌效果。1實(shí)驗(yàn)部分1.1蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)菌、革蘭氏陰性菌對(duì)菌株的選擇殼聚糖,市售工業(yè)品,脫乙酰度大于90%。其它均為化學(xué)純。細(xì)菌包括革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaure)、革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)、真菌白色念珠菌(Candidaalbicans),由青島市市立醫(yī)院提供。1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備GXZ智慧光照培養(yǎng)箱,寧波東南儀器有限公司;510PFT-IR紅外儀,美國(guó)Nicolet有限公司。1.3碘甲烷的制備將一定量的殼聚糖與N-甲基吡咯烷酮置于四口燒瓶中,室溫分散12h,然后加入一定量的碘甲烷和NaOH的混合溶液,反應(yīng)過(guò)程中N2氣保護(hù),反應(yīng)后將產(chǎn)物在攪拌下緩慢加入到丙酮溶液中,經(jīng)過(guò)濾,乙醇洗滌,真空干燥備用。1.4皮聚糖季銨鹽抗菌實(shí)驗(yàn)1.4.1最低抑菌濃度測(cè)定取適量10mg·mL-1殼聚糖季銨鹽水溶液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中,加入培養(yǎng)基(細(xì)菌于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,真菌于馬鈴薯培養(yǎng)基中,下同)混合均勻,使最終濃度分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25mg·mL-1,然后劃線接種菌,試樣置于生化培養(yǎng)箱(細(xì)菌37℃、真菌28℃)中培養(yǎng)(細(xì)菌24h、真菌38h),觀察菌的生長(zhǎng)情況。并以完全無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最低抑菌濃度(MIC)。另外,以未加殼聚糖季銨鹽的瓊脂試樣為對(duì)照。1.4.2ph對(duì)殼聚糖季銨鹽細(xì)菌生長(zhǎng)的影響用1mol·L-1HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為5.4、6.0、6.5、7.0和7.5,取1mL殼聚糖季銨鹽溶液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中,加入9mL培養(yǎng)基充分混合,細(xì)菌培養(yǎng)24h、真菌38h,觀察菌的生長(zhǎng)情況,比較不同pH對(duì)測(cè)試菌的影響。1.5菌種生長(zhǎng)情況的測(cè)定取等量菌懸液加入到不同濃度待測(cè)樣品溶液中,置恒溫?fù)u床上150rpm下培養(yǎng)1h,取不同量的混合液涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,37℃恒溫培養(yǎng)24h后,觀察各試樣上菌生長(zhǎng)情況。無(wú)菌生長(zhǎng)的濃度為最低殺菌濃度(MBC),計(jì)算殺菌率。2結(jié)果與討論2.1殼聚糖—紅外光譜分析圖1是殼聚糖及其改性產(chǎn)物季銨鹽的紅外光譜圖。從圖1中曲線a可看出,殼聚糖在1601cm-1處有較強(qiáng)的吸收峰,這是殼聚糖分子中的—NH2的變形振動(dòng)吸收峰,而在b曲線中經(jīng)過(guò)改性的殼聚糖的紅外光譜中該吸收峰消失,而且出現(xiàn)了1473cm-1和1408cm-1兩處吸收峰,并在1374cm-1處也有較明顯的吸收峰,這是—N+H(CH3)2或—N+(CH3)3振動(dòng)偶合使對(duì)稱彎曲振動(dòng)裂為強(qiáng)度差別較大的3條譜帶。2.2海洋聚糖銨鹽菌的性能影響因素2.2.1最適抑菌濃度不同濃度殼聚糖季銨鹽的抑菌效果見(jiàn)表1。由表1可看出,隨著濃度的增加,抑菌率都有所增強(qiáng),但對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性最強(qiáng),最小抑菌濃度(MIC)為1.0mg·mL-1;白色念珠菌次之在1.0mg·mL-1時(shí)抑菌率達(dá)到了97.5%;濃度為1.25mg·mL-1時(shí),對(duì)3種不同菌屬抑菌率均達(dá)100%。2.2.2殼聚糖季銨鹽的抑菌效果pH對(duì)殼聚糖季銨鹽抑菌性能影響見(jiàn)圖2。由圖2可看出,在未添加殼聚糖季銨鹽時(shí),菌落數(shù)隨著pH的增高而增多,即在堿性條件下有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。而添加殼聚糖季銨鹽后,試樣上的菌落數(shù)隨著pH值的增加而減少。說(shuō)明殼聚糖季銨鹽在堿性條件下具有更強(qiáng)的抑菌性能。這是因?yàn)樵谥行约叭鯄A性環(huán)境中,細(xì)菌蛋白質(zhì)帶有更多的負(fù)電荷,增加了與殼聚糖季銨鹽之間的相互作用,所以在弱堿性條件下具有更強(qiáng)的抑菌活性,這與普通季銨鹽消毒劑的規(guī)律相吻合。2.3細(xì)菌抑菌和添加細(xì)菌殼聚糖季銨鹽的殺菌性見(jiàn)圖3。可看出,殼聚糖季銨鹽隨著濃度的增加殺菌率升高,但殺死細(xì)菌的效果不如抑菌效果顯著,且用量多。在濃度為7.5mg·mL-1時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率可達(dá)到100%;濃度為10mg·mL-1時(shí),對(duì)大腸桿菌的殺菌率達(dá)到了100%。2.4殼聚糖季銨鹽的抑菌作用殼聚糖及其衍生物的抗菌機(jī)理比較復(fù)雜,但總的來(lái)說(shuō),主要是由于破壞了細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的正常生長(zhǎng),從而起到了抗菌作用。因殼聚糖本身是陽(yáng)離子大分子聚合物,可與細(xì)胞表面帶有負(fù)電荷的的蛋白質(zhì)、磷壁酸、脂多糖等發(fā)生絮凝作用,破壞細(xì)胞質(zhì)膜的滲透屏障作用,導(dǎo)致細(xì)胞的完整性破壞,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失,達(dá)到抗菌作用;或吸附帶有負(fù)電荷的細(xì)菌,干擾細(xì)胞壁的合成,使細(xì)胞壁溶解而死亡。由此可見(jiàn),殼聚糖季銨鹽的抑殺菌作用,主要作用目標(biāo)位點(diǎn)是細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜,使細(xì)胞膜喪失了屏障作用,故殼聚糖季銨鹽有強(qiáng)的抑菌活性,而殺菌活性較低。殼聚糖季銨鹽對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性更加明顯。金黃色葡萄球菌是典型的革蘭氏陽(yáng)性菌,革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁是由磷壁酸組成。而革蘭氏