海洋沉積物中放線菌分離技術(shù)的研究

海洋放線菌由于其獨(dú)特的代謝活性、獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征和功能，引起了人們的關(guān)注。它是海洋藥物開發(fā)中的重要微生物資源。而海洋放線菌的分離是海洋放線菌資源開發(fā)的關(guān)鍵一步,雖然有較多關(guān)于陸地放線菌分離方法的報(bào)道,但由于陸地與海洋間的環(huán)境條件不同可能造成在分離兩種生境下生存的放線菌時(shí)分離方法上會(huì)存在較大的差異。實(shí)驗(yàn)證明,樣品的預(yù)處理方法對(duì)樣品中放線菌的分離效果能產(chǎn)生重要影響。中國海域廣闊,但對(duì)海洋放線菌資源的研究和開發(fā)卻非常有限。近幾年,雖然有關(guān)不同海域海洋放線菌多樣性的研究報(bào)道日益增多,但對(duì)南麂島海域海洋放線菌資源的研究鮮有報(bào)道。南麂島地處亞熱帶,坐落于浙江平陽縣鰲江口外30海里的東海海面,位于27°27′N,121°05′E,因其復(fù)雜的海洋氣候環(huán)境和豐富的海洋生物資源而聞名。海域底質(zhì)以粉砂質(zhì)粘土為主。因其遠(yuǎn)離大陸,受人類活動(dòng)及污染程度較小,優(yōu)越的海洋自然環(huán)境條件,使其具有豐富的海洋生物多樣性,被譽(yù)為“貝藻王國”。1998年12月成為中國目前唯一納入聯(lián)合國教科文組織世界生物圈保護(hù)區(qū)網(wǎng)絡(luò)的海洋類型自然保護(hù)區(qū)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)南麂島獨(dú)特的海洋環(huán)境,選擇南麂島海域的沉積物樣品為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究了幾種不同的沉積物樣品預(yù)處理方法對(duì)該海域中海洋放線菌分離效果的影響,并首次探討了羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液在沉積物樣品預(yù)處理中對(duì)海洋放線菌孢子的分散效果,旨在為該海域的海洋放線菌分離培養(yǎng)建立有效的分離方法,為進(jìn)一步開發(fā)該海域的海洋放線菌資源奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1細(xì)胞小區(qū)選擇含腐殖質(zhì)豐富的南麂島養(yǎng)殖區(qū)附近海域?yàn)楹Ｄ嗖杉瘏^(qū),水深約15m。隨機(jī)采集12份海洋沉積物樣品,用無菌三角燒瓶盛放,放于冰盒保存,次日送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。并經(jīng)初步實(shí)驗(yàn)研究后,以含海洋放線菌最豐富的12號(hào)樣品為供試沉積物樣品。1.2海蝦樣品的采集高氏一號(hào)培養(yǎng)基(GAU),HV培養(yǎng)基,幾丁質(zhì)培養(yǎng)基(CM),甘油精氨酸培養(yǎng)基(GAR),淀粉-酪蛋白培養(yǎng)基(SC),培養(yǎng)基均用來源于樣品采集區(qū)的陳海水配制而成。抑制劑是終質(zhì)量濃度為0.5×10-6的重鉻酸鉀。幾丁質(zhì)的制備:取海蝦透明殼質(zhì)部分,去除肉屑后,加洗衣粉煮0.5h,水洗烘干后,每10g蝦皮用20mL丙酮浸潤(rùn),再用20mL濃鹽酸浸泡成稠糊狀。海泥溶出液:稱取與樣品采集于同一地點(diǎn)的沉積物1000g,加入海水1000mL,煮沸60min,暗處放置2d后過濾,用海水定容置1000mL備用。CMC溶液:將CMC用無菌海水配置成5個(gè)稀釋度的溶液備用。1.3海水淡化處理采用稀釋涂板法。均稱取沉積物樣品1g,加入裝有玻璃珠的10mL無菌海水中激烈震蕩20min后,靜置30min,取上清液,逐級(jí)稀釋至10-3,各取0.15mL分別涂平板,每處理各設(shè)3個(gè)重復(fù),28℃培養(yǎng)7d。以10-2稀釋度計(jì)數(shù)。1.4數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用DPS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1高氏代丁酸分離取兩份沉積物樣品,一份無菌保存于4℃冰箱中,一份平鋪于無菌培養(yǎng)皿,經(jīng)24h真空干燥,然后研磨成粉做稀釋處理。用高氏一號(hào)進(jìn)行放線菌的分離。如表1所示,真空干燥處理后,細(xì)菌的數(shù)量急劇減少,而放線菌減少量較小。2.2cmc對(duì)放線菌的分離樣品經(jīng)真空干燥處理后,再經(jīng)不同濃度CMC處理,用高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行放線菌分離。分離結(jié)果如圖1。隨著CMC質(zhì)量濃度的增加,放線菌總數(shù)呈先增后減的趨勢(shì),而細(xì)菌無明顯的變化。2g/L的CMC處理樣品后,分離得到數(shù)量較多海洋放線菌。2.3溫度對(duì)放線菌的影響將風(fēng)干后的樣品經(jīng)質(zhì)量濃度為2g/L的CMC震蕩處理30min,使樣品充分分散后,放于不同水浴中處理相應(yīng)的時(shí)間。用高氏一號(hào)進(jìn)行放線菌的分離。分離結(jié)果如表2所示,隨著溫度的升高,放線菌的數(shù)量呈現(xiàn)先增后減得趨勢(shì),而細(xì)菌數(shù)量逐漸減少。并且同一溫度下經(jīng)過不同時(shí)間的處理后,放線菌分離結(jié)果也將產(chǎn)生影響。結(jié)果表明50℃處理20min所獲得的放線菌數(shù)量最多,細(xì)菌數(shù)量也不會(huì)影響到放線菌的挑選。表2續(xù)2.4不同濃度的海水配置培養(yǎng)基將樣品先后經(jīng)質(zhì)量濃度為2g/L的CMC震蕩分散處理、50℃加熱20min后,涂布于不同濃度海水配置的高氏一號(hào)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)結(jié)果顯示,60%的陳海水配置的培養(yǎng)基上,放線菌分離的數(shù)量明顯高于純海水配置的培養(yǎng)基(圖2)。2.5不同培養(yǎng)基的稀釋將樣品先后經(jīng)質(zhì)量濃度為2g/L的CMC震蕩分散處理、50℃加熱20min后,將樣品梯度稀釋涂布于60%陳海水配置的不同培養(yǎng)基。結(jié)果顯示,GAU、HAV兩種培養(yǎng)基分得的放線菌數(shù)目明顯多于其他培養(yǎng)基,而添加沉積物浸出液的培養(yǎng)基分離到得菌落數(shù)明顯多于未添加者(表3)。3關(guān)于海洋放線菌的分離將沉積物樣品經(jīng)真空干燥處理后,對(duì)放線菌的出菌率影響不大,但細(xì)菌的數(shù)量明顯減少。原因是細(xì)菌對(duì)干燥環(huán)境比較敏感,水分的散失導(dǎo)致細(xì)菌喪失活力,而大部分放線菌的孢子能夠耐受干燥。CMC因具有懸浮等作用,一定質(zhì)量濃度的CMC溶液能夠較好的分散和懸浮海泥樣品中的放線菌孢子,保證了樣品懸液的均一性。試驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn),如果CMC的質(zhì)量濃度過小則對(duì)孢子起不到懸浮及分散的作用,因?yàn)橛行╂咦涌赡芪接诘啄囝w粒上而沉降。而CMC質(zhì)量濃度過大黏度增強(qiáng),會(huì)使部分孢子粘附于吸管壁造成誤差。CMC與以往報(bào)道的0.05%十二烷基磺酸鈉(SDS)等分散劑對(duì)沉積物樣品的分散效果是否存在差異有待于進(jìn)一步地進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn),為沉積物樣品的預(yù)處理選擇一種良好分散劑提供一定的參考。放線菌的孢子具有耐熱、耐干燥的性質(zhì)。適度的熱處理不僅能夠減少細(xì)菌的數(shù)量而且能誘發(fā)某些放線菌孢子的萌發(fā),增加放線菌的出菌率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)海洋底泥樣品的熱處理溫度不宜過高,高于60℃后將降低放線菌的出菌率,建議對(duì)海洋沉積物熱處理溫度為40～60℃。采用60%的海水配置高氏一號(hào)培養(yǎng)基能增加分離到的海洋放線菌數(shù)量和種類。而培養(yǎng)基中添加沉積物浸出液對(duì)海洋放線菌的分離效果更佳,分析可能沉積物浸出液能提供其原有生活環(huán)境中的某些微量元素,從而增加了放線菌的出菌率。海水的濃度能夠影響海洋放線菌生長(zhǎng)環(huán)境的滲透壓,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)60%的海水配置的培養(yǎng)基最有利于放線菌的分離,海水質(zhì)量濃度過高造成環(huán)境滲透壓過大從而破壞菌體的細(xì)胞膜,使菌體死亡,所以配置海洋放線菌培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)該考慮所用陳海水的質(zhì)量濃度。樣品采集于離南麂島魚類養(yǎng)殖區(qū)2海里處,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明從該區(qū)采集的樣品中能分離到較多數(shù)量的放線菌,說明養(yǎng)殖區(qū)附近海域可能是海洋放線菌相對(duì)密集的地方。原因可能是養(yǎng)殖區(qū)投放的餌料殘留、生物體所產(chǎn)代謝廢物形成了該區(qū)豐富的腐