益生菌與腸道上皮細胞的關系

腸道是一個有500多種生物的微環(huán)境。單層上皮細胞將共生的微生物和病原菌與下層的免疫細胞分割構成腸道屏障,所以腸道上皮屏障是阻止感染和炎癥的防御機制的主要成分。益生菌是一類對宿主有益的微生物,能夠減輕或者阻止疾病的發(fā)生,例如腹瀉、腸易激綜合征、炎癥性腸病等。益生菌與腸道上皮屏障的相互作用機制的研究對開發(fā)利用益生菌具有重要意義。國內外研究顯示,益生菌通過增強腸道屏障、調節(jié)免疫、競爭性黏附黏膜等發(fā)揮益生性功能作用,但是其調節(jié)腸道屏障的功能作用及機制仍然不完全明晰。本文擬從腸道上皮屏障及微生態(tài)系統(tǒng)組成、益生菌增強腸道上皮屏障功能作用、微生物與腸道上皮之間的相互作用及機制3個主要方面展開綜述,旨在分析益生菌對腸道上皮屏障功能的調節(jié)作用及其作用機制。1腸道上皮屏障和微生態(tài)系統(tǒng)組成1.1細菌細胞屏障IECs被認為是胃腸道中的免疫“哨兵”,在維持宿主先天和適應性腸道黏膜免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。IECs是宿主防御病原菌入侵或者致炎性物質刺激的第1道防線,通過產生大量細胞因子和趨化因子使分散在其周圍的免疫細胞發(fā)揮免疫作用。IECs與腸道微生物菌群直接接觸,病原菌產生的炎癥反應要比腸道中共生細菌產生的炎癥反應劇烈的多。但是有報道稱,IECs對于一些不致病的共生細菌也會產生過度的炎癥反應,對一些共生細菌如鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)等會產生炎癥細胞因子[白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等]或者趨化因子[CC亞家族配體20(CCL20)]等。腸道上皮細胞通過適應機制來限制細菌的生長,減少與細菌的直接接觸以及防止細菌進入黏膜下層組織來防止自身產生過度的炎癥反應。破壞這層細胞屏障會導致機體對微生物菌群的免疫耐受能力下降,產生異常的免疫反應,甚至會引發(fā)炎癥性腸病、潰瘍性結腸炎等。單層上皮細胞將共生的微生物、病原菌和杯狀細胞分泌的黏液與下層的免疫細胞分割構成腸道屏障(圖1),所以腸道上皮屏障是阻止感染和炎癥的主要防御機制。1.2腸道微生物菌群的變化動物腸道是一個具有生物多樣性的微環(huán)境,其中生長著幾百種細菌、古生菌以及真菌,不同微生物菌群之間的交互作用形成腸道微生物穩(wěn)態(tài)。腸道微生物菌群在腸道新陳代謝、腸道上皮細胞功能、免疫系統(tǒng)以及炎癥反應信號通路等方面發(fā)揮著重要的作用。一般正常動物體內腸道微生物菌群組成相對恒定,而當機體處于外環(huán)境變化或者接受抗生素治療時,動物體內腸道微生物菌群組成會發(fā)生改變。一些疾病的發(fā)生常伴隨腸道微生物菌群失調,如腸易激綜合征、炎癥性腸病、結腸癌、酒精肝以及肥胖和其他代謝失調?；加袧冃越Y腸炎等疾病的個體與健康個體相比,腸道微生物菌群的多樣性減少,但是其機制仍然不完全清楚。益生菌為腸道微生物重要組成部分,在腸道中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用?；诩毦囵B(yǎng)技術和分子生物學檢測技術證明益生菌能夠改變動物腸道微生物菌群的組成。尼氏大腸桿菌(EscherichiacoliNissle1917,EcN)是一種常用的益生菌,普遍用于治療腸道感染疾病,ue6d1majs等用EcN飼喂母豬2周后檢測腸道微生物菌群組成變化,結果顯示與沒有飼喂EcN母豬腸道微生物菌群組成相比較,服用EcN的母豬腸道大腸桿菌菌群多樣性減少。1.3菌株組成和比例根據定義,益生菌的概念源于希臘語“對生命有益的細菌”,益生菌通常是定植于動物腸道、生殖系統(tǒng)內,能產生確切健康功效的活性有益微生物(細菌或者酵母)的總稱。常見的益生菌包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacteria)、鏈球菌屬(Streptococcus)以及少部分大腸桿菌等。一些乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和腸球菌(Enterococcus)也常被使用。益生菌主要從健康的個體中分離得到,除了對宿主有益,和共生腸道微生物菌群沒有本質的區(qū)別。益生菌發(fā)揮功能的機制包括對免疫功能進行調節(jié)、對共生細菌和病原菌發(fā)揮直接干預作用而阻止機體感染、對腸道穩(wěn)態(tài)的修復以及致病性毒素的降解。乳酸桿菌處理過的豬腸道上皮細胞通過Toll樣受體4(TLR4)介導產生的白細胞介素-6(IL-6)、IL-8表達量與未用乳酸桿菌處理的細胞的IL-6、IL-8表達量比較相對降低,顯示乳酸桿菌發(fā)揮免疫保護作用。對于病毒感染過的無菌豬產生的炎癥反應,乳酸桿菌能夠通過調節(jié)致炎性細胞因子和抗炎性細胞因子的相對水平達到維持體內免疫平衡狀態(tài)。2益菌可以提高腸道表皮屏障的功能2.1益生菌對腸道黏膜層厚度的影響在腸道組織結構中,杯狀細胞分布于整個腸道(圖2)。杯狀細胞能夠分泌黏蛋白,高度糖基化的黏蛋白分布于細胞膜或者分泌進腸腔中形成一層黏液層。在18種糖基化黏蛋白中,黏蛋白2(MUC2)是一類主要存在于腸道黏膜的糖基化黏蛋白。MUC2的N端和C端沒有被糖基化,中間的半胱氨酸殘基處高度糖基化,多糖基團具有抑制蛋白質降解的作用,同時可以提高親水性,通過二硫鍵的連接構成了黏液層的骨架。黏液層能夠保護腸道上皮細胞免受病原微生物的侵襲,同時是腸道蠕動的潤滑劑。黏蛋白能夠與腸道上皮細胞表面的糖基結合構成黏液層的下層,直接與黏膜接觸,而上層則相對疏松。黏液層的厚度從50μm到800μm不等,在30μm厚度的區(qū)域是離上皮細胞最近的無菌區(qū)域(圖1)。綜上所述,黏液層是腸道屏障的第1道防線,病原微生物必須先突破黏液層才能到達上皮細胞。經過不斷的進化,微生物形成了多種方法降解黏液層達到入侵上皮細胞的目的,比如幽門螺桿菌能夠切斷二硫鍵,綠膿桿菌(P.aeruginosa)和阿米巴蟲具有蛋白酶能夠分解黏蛋白,一些微生物還具有糖苷酶功能,能夠分解糖苷鍵等。當腸道某區(qū)域發(fā)生炎癥反應,那么該區(qū)域的黏液層會變薄,使病原微生物入侵上皮細胞變得更加容易。益生菌能夠通過增加黏蛋白的分泌量來增強腸道屏障功能,阻止病原微生物的侵襲。一些研究顯示,某些乳酸桿菌能夠黏附在Caco-2細胞或者HT29細胞表面增加黏蛋白MUC2分泌量,阻止大腸桿菌的入侵和黏附,但也有研究顯示,嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)不需要黏附在HT29細胞表面就可以有效增加MUC2的分泌量。由于體內試驗研究較少,體內的研究結果并不一致,用益生菌制劑VSL#3飼喂小鼠14d發(fā)現(xiàn)沒有改變黏蛋白分泌量和黏液層厚度,而另一研究用相同劑量的VSL#3飼喂小鼠7dMUC2表達量就增加了60倍。因此,益生菌是否在體內試驗中有效增加黏蛋白分泌和增加黏液層厚度還需要進一步的研究證明。2.2抑菌腸道屏障在腸道抗菌多肽中有2大類家族,抗菌肽和防御素(圖2)。腸道上皮細胞在受到病原微生物入侵時能夠連續(xù)分泌α-螺旋抗菌多肽。防御素進一步可以分類成主要由小腸潘氏細胞合成分泌的α-防御素和由腸道上皮細胞分泌的β-防御素。β-防御素具有抗菌功能,能夠阻止病原微生物如細菌、真菌和一些病毒入侵上皮細胞。益生菌不僅可以提高腸道上皮合成和分泌抗菌肽和防御素,還可以通過產生短鏈脂肪酸(SCFA)或者細菌素直接阻止病原體生長。益生菌合成分泌的抗菌因子可以看作是腸道上皮屏障的重要組成部分,尤其是一些能夠抑制或者殺死病原體的抗菌因子。有體外試驗研究表明,乳酸桿菌能夠通過分泌乙酸和乳酸降低pH,從而抑制大腸桿菌等病原體的生長繁殖。SCFA能夠破壞革蘭氏陰性菌病原體如腸出血性大腸桿菌、綠膿桿菌和沙門桿菌(S.typhimurium)等的外層細胞膜從而殺死病原體,SCFA的穿透能力能夠輔助其他抗菌因子更加容易地進入病原體細胞內發(fā)揮抗菌作用。細菌素是一類可以由益生菌或者共生微生物合成分泌的多肽,能夠殺死細菌或者抑制細菌生長。細菌素不僅能夠穿透革蘭氏陰性菌的細胞膜內層,還可以干擾細菌的細胞壁合成,唾液乳桿菌(L.salivarius)能夠合成分泌細菌素ABP-118抑制芽孢桿菌屬(Bacillus)、利斯特菌屬(Listeria)、腸球菌屬(Enterococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)等的生長繁殖,而大部分乳酸桿菌的生長不受其抑制,說明細菌素ABP-118對于腸道微生物定植具有選擇性以及限制病原微生物的生長繁殖。2.3s空間復合免疫相關抗體的增強在腸道黏液中存在有大約80%的漿細胞,同時腸道黏液中的免疫球蛋白A(IgA)比其他部位多(圖2),派爾集合淋巴結是主要的IgA生成部位。免疫球蛋白M(IgM)的B細胞聚集到派爾集合淋巴結中受到T細胞和樹突細胞激活增殖,IL-6、白細胞介素-10(IL-10)和轉化生長因子-β(TGF-β)使IgM的B細胞轉換成能夠生成IgA的B細胞,最終B細胞分化成IgA漿細胞。IgA二聚體通過腸道上皮細胞上的免疫球蛋白受體被分泌到腸腔中,即sIgA。IgG和IgA都存在于腸道黏液中,IgA被認為是黏液免疫反應中最主要的一類抗體,IgG則被認為是在外來抗原的黏液免疫反應中起到了重要的作用。在腸道屏障的黏液層中,sIgA通過與病原微生物的表面抗原結合來保護腸道上皮細胞不受微生物侵襲。sIgA包裹病原微生物后形成一層親水性的膜,能被腸道上皮細胞上的多糖黏蛋白所排斥。IgA與抗原結合形成的復合體還能結合到一些免疫細胞(如中性粒細胞、樹突狀細胞、單核細胞以及巨噬細胞等)的人IgAFc受體FcαRI(CD89)上,受體被激活后能夠使免疫細胞發(fā)揮抗菌作用,包括細胞毒性作用、吞噬作用和生成抗菌性過氧化物等,根據細胞種類的不同以及IgA配體的不同還能激活抗炎性信號通路或者致炎性信號通路。免疫排斥功能不僅能保護腸道上皮細胞免受病原微生物的侵襲,同時還能維持腸道微生物菌群的穩(wěn)態(tài)。研究表明,當腸道上皮受到病原微生物侵襲時,益生菌能提高機體產生病原體特異性和非特異性的sIgA,但是并沒有提高益生菌特異性的sIgA的分泌量,當用酪乳桿菌(L.casei)飼喂小鼠之后,IgA和IL-6的分泌量增加,但并不產生對益生菌酪乳桿菌特異性的抗體,表明腸道免疫系統(tǒng)對于益生菌沒有特異性。不是所有的益生菌在sIgA表達方面都具有一樣的效果,益生菌鼠李糖乳桿菌和乳雙歧桿菌混合物并沒有引起小鼠腸道sIgA分泌量的增高,而當小鼠用益生元或者合生元飼喂后卻引起sIgA的分泌量提高,表明刺激物的多樣性能夠增強腸道免疫系統(tǒng)的免疫排斥反應。2.4調節(jié)性表面蛋白益生菌可以通過與病原微生物競爭性黏附腸道上皮細胞的結合位點來對抗入侵的病原微生物(圖2),鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌可以競爭性附著于HEp-2細胞系和T84細胞系的黏附位點,減少細胞表面的黏附位點從而阻止如腸致病性大腸埃希菌等病原微生物的入侵。研究顯示,乳酸桿菌的保護作用能夠通過熱激失活,但是一些乳酸桿菌的表面蛋白依舊能夠與腸道上皮細胞結合。汪海峰等對于S層蛋白、黏膜結合蛋白和胞外間質黏附的調節(jié)性表面蛋白等乳酸桿菌表面蛋白結構特征及其在腸道黏附中的作用與機制做了全面的綜述。研究表明,經純化的瑞士乳桿菌(L.helveticus)的表面蛋白能夠阻止腸毒性大腸埃希桿菌對腸道上皮細胞的黏附,維持腸道屏障的完整性。一些乳酸桿菌還能夠直接與沙門氏菌等病原微生物競爭位于Caco-2細胞表面和黏液層的位點,替換已經結合在黏附位點上的病原微生物,相關研究顯示,益生菌EcN能夠分泌一種非細菌素的成分作用于病原微生物或者宿主細胞來減弱一些病原微生物的黏附,布拉氏酵母菌(S.boulardii)分泌的一種熱不穩(wěn)定的物質能夠降低病原菌在上皮細胞上的黏附能力,以上表明益生菌能夠通過多種方式阻止病原微生物黏附于腸道上皮,從而增強腸道屏障功能。2.5ccludin蛋白在腸道屏障功能的變化腸道上皮細胞的胞間連接,是腸道屏障發(fā)揮功能的基礎。許多成分構成了胞間連接復合體:緊密連接、黏附連接、間隙連接以及細胞橋粒等(圖3)。腸道上皮細胞的緊密連接相關復合體蛋白包含有胞內和細胞表面蛋白。胞內蛋白有ZO-1、ZO-2、ZO-3、Cingulin、7H6、Symplekin以及ZA-1。膜蛋白包括在緊密連接中發(fā)現(xiàn)的多種跨膜蛋白,如Occludin、Claudin等,用來連接周圍的腸道上皮細胞組成緊密連接。病原微生物通過各種毒力因子攻擊緊密連接蛋白入侵腸道屏障。大腸桿菌通過將Occludin蛋白從緊密連接處轉移至胞質內從而摧毀緊密連接。梭狀芽胞桿菌(C.difficile)的毒力因子A和B通過溶解蛋白Occludin、ZO-1、ZO-2進入腸道屏障。一種從霍亂弧菌提取的Zonulin蛋白通過與細胞膜受體結合后分解胞內的緊密連接。Zonulin蛋白的失調在許多疾病中都出現(xiàn),導致細胞間連接不完整引起病原微生物的侵襲感染。益生菌通過提高緊密連接蛋白的表達量實現(xiàn)增強腸道上皮的屏障功能。Dai等在蛋白水平的研究顯示,益生菌VSL#3能夠通過激活p38和胞外信號調劑激酶(ERK)信號分子通路保護腸道上皮屏障,提高緊密連接蛋白的表達量增強腸道上皮屏障功能。Resta-Lenert等研究表明,嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和嗜酸乳桿菌能夠激活p38、ERK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)信號分子通路,提高ZO-1和Occludin蛋白磷酸化表達量,增強HT-29細胞和Caco-2細胞的屏障功能,這與Dai等研究結果相一致。基因水平的研究顯示,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)MB452能夠改變腸上皮細胞緊密連接相關基因的表達量,如編碼Occludin和細胞骨架的基因。同樣有報道稱EcN能提高腸道上皮細胞的緊密連接蛋白表達,Ukena等用EcN飼喂小鼠后ZO-1的mRNA表達量和蛋白表達量都相應上升,同時修復腸道黏膜層增強上皮屏障功能。益生菌在腸道中還有其他的免疫調控效應,包括增強樹突細胞和T細胞免疫功能,阻止致炎性細胞因子的合成以及增強自然殺傷細胞的作用。益生菌刺激腸道免疫系統(tǒng)的功能和機制需要做進一步深入研究。3微生物與腸道上皮的相互作用和機制3.1子模式和跨膜prrs微生物菌群通過與黏膜免疫系統(tǒng)交互作用,調節(jié)腸道上皮與黏膜系統(tǒng)的生長、存活以及炎癥控制。本課題組章文明等對腸道上皮細胞免疫調節(jié)相關受體做了全面的綜述。腸道黏膜具有跨膜或者胞質內的受體,即模式識別受體(PRRs),它們通過特異性識別并結合特異性微生物大分子配體(圖4)。這些配體即是微生物相關分子模式(MAMPs),包括脂多糖、鞭毛、肽聚糖以及甲?；嚯?表1)?？缒RRs包括外膜和內體漿質隔室的代表Toll樣受體(TLRs),以及胞內受體的代表核苷酸結合寡聚化結構域NOD樣受體(NLRs),它們能夠保護胞質內隔室。微生物配體與黏膜受體的相互作用使機體產生免疫耐受,從而使核心微生物菌群可以穩(wěn)定地生長。益生菌或者共生菌群能夠競爭腸道上皮細胞受體位點,抑制病原微生物黏附,阻止病原微生物在腸道中形成規(guī)模,所以建立一個由多種原生共生微生物種群構成的穩(wěn)定微生物菌群對宿主是有利的。在中性粒細胞的表面,跨膜受體屬于甲?；嚯氖荏w(FPRs),是一類高親和力的PRRs。當有對應的MAMP激活FPRs時,FPRs能夠激活中性粒細胞信號轉導通路,產生還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADPH)氧化物依賴的活性氧以提高嗜菌細胞的運動性。一些中性粒細胞的FPRs在IECs上被發(fā)現(xiàn),表明IECs上的FPRs可能與在吞噬細胞中的作用相類似,維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)平衡。3.2b信號通路引導益生菌發(fā)展在腸道黏膜中,PRRs的激活啟動調節(jié)通路,如核轉錄因子-κB(NF-κB)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路以及細胞凋亡蛋白酶依賴的信號級聯(lián)反應來產生各類細胞因子和趨化因子或者引起細胞凋亡(圖4)。NF-κB被認為是在炎癥反應中起重要作用的一類因子,能夠調控一些細胞因子的表達,如TNF-α、IL-6、γ-干擾素(IFN-γ)等,MAPK在炎癥反應中也發(fā)揮著非常重要的調節(jié)作用,不同配體與相應的PRRs結合后通過p38、ERK、JNK的磷酸化來激活MAPK級聯(lián)反應產生免疫應答效應,激活的MAPK受各類與炎癥反應相關的信號轉導通路調節(jié),比如細胞因子以及其基因,通過NF-κB從胞質進入核內與DNA結合來調節(jié)MAPK級聯(lián)反應,所以抑制NF-κB通路和MAPK通路對于治療炎癥反應是一項有效的措施。腸道黏膜對于微生物的轉錄應答是不同的,一些PRR配體為益生菌或者共生細菌受體,而腸道黏膜對于這些細菌的應答并不引起腸道黏膜的炎癥反應,這些益生菌或者共生細菌通過減輕病原細菌誘導產生的致炎性免疫因子應答反應來發(fā)揮保護腸道上皮屏障的作用。由病原菌或者其他應激信號引起的炎癥或者細胞凋亡,是由NF-κB信號通路和細胞凋亡蛋白酶依賴的信號級聯(lián)反應來控制,大部分益生菌通過阻止上皮細胞蛋白酶功能和阻止NF-κB的負調節(jié)因子抑制蛋白-κB(IκB)降解,或者通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)依賴的信號通路將NF-κB亞基p65從細胞核中輸導出來從而限制NF-κB通路。益生菌還能夠誘導轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路和MMP3K信號通路,介導抗炎和抗細胞凋亡作用。細菌脂蛋白和腸道上皮細胞Toll樣受體2(TLR2)相互作用能夠激活骨髓分化主要響應基因88(Myd88),隨后集合快速集合死亡域(FADD)激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8信號通路發(fā)生細胞凋亡。鞭毛在細胞凋亡應答中起了重要作用,Toll樣受體5(TLR5)和鞭毛相互作用啟動促炎反應信號通路和促細胞凋亡信號通路,具有鞭毛結構的病原微生物與腸道上皮細胞接觸,通過激活TLR5來啟動促炎反應的產生,巨噬細胞利用胞內白細胞介素-1β(IL-1β)轉換酶蛋白酶激活因子(IPAF)或者凋亡抑制蛋白-5(NAIP-5)來識別胞質內鞭毛,應答IL-1或者引起細胞凋亡。3.3抗炎性細胞因