1.2基因工程的基本操作程序?qū)W習(xí)目標(biāo)：1、簡(jiǎn)述基因工程原理及基本操作程序。2、記住目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法。3、理解目的基因檢測(cè)與鑒定的方法重點(diǎn)：基因工程基本操作程序的四個(gè)步驟，難點(diǎn)：1、從基因文庫中獲取目的基因。

2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?？键c(diǎn)：基因工程原理及基本操作程序三、基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲?。?）目的基因：編碼蛋白質(zhì)的______。

基因1.目的基因的獲?。?）從基因文庫中獲取目的基因：如從基因組文庫或cDNA文庫中獲取。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：利用DNA復(fù)制的原理在體外特異性的復(fù)制某DNA片段以獲得呈指數(shù)方式增加的目的基因。（3）人工合成法：通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。(3)PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理DNA雙鏈復(fù)制(堿基互補(bǔ)配對(duì))原料四種游離的脫氧核苷酸條件模板、ATP、酶等PCR技術(shù)DNA復(fù)制不同點(diǎn)解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化場(chǎng)所體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)酶熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)細(xì)胞內(nèi)含有的DNA聚合酶結(jié)果在短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心（1）由圖可知載體的組成：_________、啟動(dòng)子、終止子、__________。目的基因標(biāo)記基因①啟動(dòng)子、終止子:是基因轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)和終點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)控作用。②標(biāo)記基因:作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因,從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來,如抗生素抗性基因。③目的基因：能控制特定性狀的外源基因。（2）構(gòu)建目的：①使________在_________中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代；②使________能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。目的基因受體細(xì)胞目的基因(3)基因表達(dá)載體的構(gòu)建步驟

導(dǎo)入的目的基因的表達(dá)需要調(diào)控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有啟動(dòng)子，之后需有終止子。3．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2＋處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T－DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子4.目的基因的檢測(cè)與鑒定【點(diǎn)撥】啟動(dòng)子、終止子與起始密碼子、終止密碼子不同：?jiǎn)?dòng)子、終止子在DNA上,在遺傳信息轉(zhuǎn)錄時(shí)起調(diào)控作用；而起始密碼子、終止密碼子在mRNA上,在翻譯時(shí)起作用,決定翻譯的開始和結(jié)束?！镜淅?xùn)練1】我國科學(xué)家成功克隆了控制水稻理想株型的關(guān)鍵多效基因IPA1。研究發(fā)現(xiàn)，基因IPA1發(fā)生突變后，會(huì)使水稻穗粒數(shù)和千粒重（以克表示的一千粒種子的重量）增加，同時(shí)莖稈變得粗壯，增加了抗倒伏能力。實(shí)驗(yàn)顯示，將突變后的IPA1基因?qū)氤Ｒ?guī)水稻品種，可以使其產(chǎn)量增加10％以上。下圖表示該水稻新品種的簡(jiǎn)易培育流程，據(jù)圖回答：（1）上圖所示流程中步驟①是實(shí)驗(yàn)所用技術(shù)的核心步驟。此步驟使_________和_________構(gòu)成_________

，常用的工具酶是________。突變的IPA1基因 Ti質(zhì)粒重組DNA限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶（2）若要在體外擴(kuò)增IPA1基因可采用PCR技術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三個(gè)步驟，第一步是“變性”即解旋，這一步驟如果發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，是在__________的作用下完成的。DNA解旋酶（3）從變異類型上分析，該水稻的新性狀應(yīng)該屬于可遺傳變異中的__________

。（4）④過程應(yīng)用的主要生物技術(shù)是_______________?；蛑亟M植物組織培養(yǎng)【互動(dòng)探究】（1）圖中將目的基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞常用的方法是什么？提示：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。分析：將目的基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。將目的基因?qū)雱?dòng)物受體細(xì)胞常用顯微注射技術(shù)。（2）如何檢測(cè)導(dǎo)入水稻新品種植株的目的基因是否表達(dá)？提示：進(jìn)行抗原—抗體雜交法。分析：檢測(cè)導(dǎo)入的目的基因是否表達(dá)常用抗原—抗體雜交法或進(jìn)行個(gè)體水平的檢測(cè)?！靖呖季剧姟?/p>

1.目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位。2.基因工程操作過程中第三步?jīng)]有堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象第一步存在逆轉(zhuǎn)錄法獲得DNA，第二步存在黏性末端連接現(xiàn)象，第四步檢測(cè)存在分子水平雜交方法?！镜淅?xùn)練2】（2011·山東高考改編）人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型常用于致病機(jī)理的探討及治療藥物的篩選。利用正常大鼠制備遺傳性高血壓轉(zhuǎn)基因模型大鼠的流程如圖所示。（1）圖中的高血壓相關(guān)基因作為________，質(zhì)粒作為_______，二者需用___切割后連接成重組載體，該過程與質(zhì)粒上含有__________有關(guān)。（2）重組DNA導(dǎo)入的受體細(xì)胞是大鼠的__________細(xì)胞，常用的方法是_________。在DNA重組過程中核心的操作是________。（3）子代大鼠如果__________和__________，即可分別在分子水平和個(gè)體水平上說明高血壓相關(guān)基因已成功表達(dá)，然后可用其建立高血壓轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。（4）在上述轉(zhuǎn)基因大鼠的培育過程中，所用到的主要胚胎工程技術(shù)是體外受精、早期胚胎培養(yǎng)和________。目的基因 載體同一種限制性核酸內(nèi)切酶受精卵限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)顯微注射技術(shù) 基因表達(dá)載體的構(gòu)建檢測(cè)到相應(yīng)蛋白質(zhì)已患高血壓胚胎移植【解題指南】1.考查實(shí)質(zhì)本題主要考查基因工程的操作程序，涉及到胚胎工程技術(shù)。2.解題關(guān)鍵高血壓相關(guān)基因與質(zhì)粒形成重組DNA后導(dǎo)入到受精卵細(xì)胞中，是DNA重組技術(shù)?！窘馕觥浚?）根據(jù)題干中“利用正常大鼠制備遺傳性高血壓轉(zhuǎn)基因模型大鼠”推出，目的基因?yàn)榕c高血壓相關(guān)的基因。為使目的基因與載體結(jié)合需用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割。（2）重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中，植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞導(dǎo)入目的基因的方式不同，動(dòng)物細(xì)胞主要用顯微注射技術(shù)將重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞中?；蚬こ滩僮鞯牡诙?，即基因表達(dá)載體的構(gòu)建是整個(gè)過程中的關(guān)鍵。（3）如果檢測(cè)到相應(yīng)蛋白質(zhì)，即可在分子水平說明目的基因已經(jīng)表達(dá)，如果檢測(cè)子代大鼠已患高血壓，即可在個(gè)體水平說明目的基因已經(jīng)表達(dá)。

(4)在上述轉(zhuǎn)基因大鼠的培育過程中，所用到的主要胚胎工程技術(shù)是體外受精、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植。早期胚胎需要移植入體內(nèi)，以提供一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境和充足的營養(yǎng)供應(yīng)。【互動(dòng)探究】（1）如果把鼠換成植物，則導(dǎo)入受體細(xì)胞的常用方法改變嗎？提示：變成農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。分析：植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞具有不同的特點(diǎn)，導(dǎo)入的方法是根據(jù)操作的需要進(jìn)行的，如利用農(nóng)桿菌易感染植物的特性。（2）分子水平檢測(cè)除蛋白質(zhì)檢測(cè)外還有什么檢測(cè)方法?提示：DNA分子雜交、核酸分子雜交。分析：利用DNA探針檢測(cè)目的基因或相應(yīng)的mRNA存在與否，說明目的基因是否存在或是否轉(zhuǎn)錄。1.（2012·福州模擬）浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院喻景權(quán)教授的課題組最新研究發(fā)現(xiàn)，一種植物激素——油菜素內(nèi)酯能促進(jìn)農(nóng)藥在植物體內(nèi)的降解和代謝。研究人員發(fā)現(xiàn)，用油菜素內(nèi)酯處理后，許多參與農(nóng)藥降解的基因(如P450和GsT)的表達(dá)和酶活性都得到提高，在這些基因的“指導(dǎo)”下合成的蛋白酶能把農(nóng)藥逐漸轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)或低毒無毒物質(zhì)，有的則被直接排出體外。某課題組進(jìn)一步進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)操作，請(qǐng)回答：（1）獲得油菜素內(nèi)酯基因的方法有_____________（舉二項(xiàng)即可）。第①步用PCR技術(shù)擴(kuò)增基因時(shí)用到的耐高溫的酶通常是指_____________。步驟②用到的酶有_____________。（2）圖中導(dǎo)入重組質(zhì)粒的方法是______________。在導(dǎo)入之前應(yīng)用______________處理。（3）導(dǎo)入重組質(zhì)粒以后，往往還需要進(jìn)行檢測(cè)和篩選，可用

______________制成探針，檢測(cè)是否導(dǎo)入了重組基因；在培養(yǎng)基中加入______________可將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。（4）請(qǐng)你為該課題命名______________。（5）請(qǐng)你說說該研究發(fā)現(xiàn)的生態(tài)學(xué)意義：___________________________________?！窘馕觥浚?）油菜素內(nèi)酯基因是目的基因，獲得目的基因的方法有：從cDNA文庫中獲取、從基因文庫中獲取、人工合成目的基因或利用PCR技術(shù)擴(kuò)增等。PCR技術(shù)中耐高溫的酶是DNA聚合酶（Taq酶）。步驟②是對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行剪切和拼接，要用到限制酶和DNA連接酶。（2）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)菌中，采用Ca2+轉(zhuǎn)化法，導(dǎo)入前應(yīng)用CaCl2溶液處理，成為感受態(tài)細(xì)胞，增加受體細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。（3）對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)和篩選中應(yīng)用紅霉素抗性基因制成探針，檢測(cè)是否導(dǎo)入重組基因；為篩選出含有目的基因的細(xì)胞可在培養(yǎng)基中加入紅霉素。（4）課題命名可以是：探究油菜素內(nèi)酯能否促進(jìn)土壤中農(nóng)藥的分解。（5）該項(xiàng)研

究的意義：加速農(nóng)藥的分解，降低植物體內(nèi)的農(nóng)藥含量，有利于環(huán)境保護(hù)和人體健康。答案：（1）從cDNA文庫中獲取、從基因文庫中獲取、人工合成目的基因或利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（任答兩項(xiàng)即可）Taq酶限制酶和DNA連接酶（2）Ca2+轉(zhuǎn)化法 氯化鈣溶液（3）紅霉素抗性基因 紅霉素（4）探究油菜素內(nèi)酯能否促進(jìn)土壤中農(nóng)藥的分解（5）加速農(nóng)藥的分解，降低植物體內(nèi)的農(nóng)藥含量，有利于環(huán)境保護(hù)和人體健康2.(2010·福建高考)紅細(xì)胞生成素（EPO）是體內(nèi)促進(jìn)紅細(xì)胞生成的一種糖蛋白，可用于治療腎衰性貧血等疾病。由于天然EPO來源極為有限，目前臨床使用的紅細(xì)胞生成素主要來自于基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組人紅細(xì)胞生成素（rhEPO），其簡(jiǎn)要生產(chǎn)流程如圖。請(qǐng)回答：（1）圖中①所指的是_______________技術(shù)。（2）圖中②所指的物質(zhì)是_______________，③所指的物質(zhì)是

_______________。（3）培養(yǎng)重組CHO細(xì)胞時(shí)，為便于清除代謝產(chǎn)物，防止細(xì)胞產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞自身造成危害，應(yīng)定期更換_____________。（4）檢測(cè)rhEPO的體外活性需用抗rhEPO的單克隆抗體。分泌該單克隆抗體的____________細(xì)胞，可由rhEPO免疫過的小鼠B

淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合而成?！窘馕觥勘绢}主要以人紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)為材料來考查基因工程和細(xì)胞工程中動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、制備單克隆抗體技術(shù)。獲取目的基因的方法有四種（從基因文庫中獲取、用PCR擴(kuò)增技術(shù)、用反轉(zhuǎn)錄法、用化學(xué)合成法），由圖以核DNA為模板獲得目的基因的方法可知①為PCR技術(shù)。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的模板是mRNA。由題意可知重組CHO細(xì)胞適用于生產(chǎn)重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO），所以重組CHO細(xì)胞能夠表達(dá)出重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO）或者紅細(xì)胞生成素。培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞是用液體培養(yǎng)基即培養(yǎng)液，細(xì)胞從培養(yǎng)液中吸收營養(yǎng)，并同時(shí)向培養(yǎng)液中排放代謝廢物，當(dāng)代謝廢物積累時(shí)會(huì)危害細(xì)胞，因此要不斷更新培養(yǎng)液。制備單克隆抗體是讓B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，然后由雜交瘤細(xì)胞來分泌抗體。答案：（1）PCR（2）mRNArhEPO

（3）培養(yǎng)液（4）雜交瘤3.(2011·海南高考)回答有關(guān)基因工程的問題：（1）構(gòu)建基因工程表達(dá)載體時(shí)，用不同類型的限制酶切割DNA

后，可能產(chǎn)生黏性末端，也可能產(chǎn)生________末端。若要在限制酶切割目的基因和質(zhì)粒后使其直接進(jìn)行連接，則應(yīng)選擇能使二者產(chǎn)生________（相同、不同）黏性末端的限制酶。（2）利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素時(shí)，構(gòu)建的表達(dá)載體含有人胰島素基因及其啟動(dòng)子等，其中啟動(dòng)子的作用是____________。在用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，常用____________處理大腸桿菌，以利于表達(dá)載體進(jìn)入；為了檢測(cè)胰島素基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，可用標(biāo)記的胰島素基因片段作探針與mRNA雜交，該雜交技術(shù)稱為____________。為了檢測(cè)胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA是否翻譯成____________，常用抗原—抗體雜交技術(shù)。（3）如果要將某目的基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入植物細(xì)胞，先要將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的___________中，然后用該農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，通過DNA重組將目的基因插入植物細(xì)胞的____________上。【解析】（1）限制酶切割產(chǎn)生兩種末端：黏性末端和平末端；若用DNA連接酶連接兩個(gè)末端，兩個(gè)末端必須是相同的。（2）基因工程檢測(cè)的方法：檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入，使用DNA分子雜交技術(shù)；檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄，使用分子雜交技術(shù)；檢測(cè)是否形成蛋白質(zhì)，使用抗原—抗體雜交技術(shù)。（3）基因工程的目的是獲得穩(wěn)定遺傳的新品種，因此要把