響應(yīng)面法優(yōu)化鎖陽黃酮超聲提取工藝

cyboryltra俗稱“老藥”，也被稱為羊咬不拉。它是鎖陽科的一種多年生生長草本植物，通常生長在鎖陽科的白刺科。是所有寄生蟲的后代。近年來,鎖陽的保健價(jià)值已被廣泛重視,化學(xué)成分被逐步揭示,且對其生理、藥理作用也有了更廣泛的認(rèn)識。目前,有關(guān)鎖陽總黃酮提取方法的報(bào)道較多,其中超聲提取優(yōu)于其他傳統(tǒng)方法,但均未對超聲條件進(jìn)行篩選。因此,為考慮各因素對鎖陽黃酮提取率影響的變化規(guī)律及交互作用,本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化實(shí)驗(yàn),以期獲得鎖陽黃酮超聲提取的最佳工藝。為合理開發(fā)鎖陽植物資源和藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù),為進(jìn)一步的化學(xué)成分分析和藥理活性研究作基礎(chǔ)。1實(shí)驗(yàn)材料1.1天麻的定義KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);AB104-N電子天平(Mettle-Toledo);CARY50ProbeUV-Visiblespectrophotometer(VARI-ANAustraliaRTYLTD),Exceed-Da-20型艾柯純水儀(成都康寧實(shí)驗(yàn)純水儀器廠)。1.2無水乙醇、亞硝酸、微量元素鋁的含量測定蘆丁(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:F20080313,純度95%);無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁等均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水,由純水儀制得。鎖陽由甘肅省瓜州億得生物科技有限公司提供。2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果2.1黃酮含量測定：樣品溶液2.1.1具塞試劑的制備精密稱取蘆丁對照品25.3mg,以50%乙醇(水浴微熱或超聲)溶解并定容至100mL,得對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL分別置于10mL具塞試管中,加50%乙醇使為5mL。各精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL,搖勻,放置6min;再各精密加入10%硝酸鋁0.3mL,搖勻,放置6min;加4%氫氧化鈉4mL,最后用50%的乙醇定容至10mL,放置15min以試劑空白于510nm處測吸光度。以吸光度對蘆丁濃度進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:Y=11.66X+0.0001(R=0.9996)。2.1.2鎖陽提取液的制備精密稱取鎖陽粉末1.0000g,以不同的乙醇濃度、提取次數(shù)、超聲功率、料液比、提取溫度及超聲提取時(shí)間為因素,制得鎖陽提取液。精密吸取樣品溶液5mL,用“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下方法測定吸光度,計(jì)算總黃酮提取率。2.2單因素研究和結(jié)果2.2.1乙醇濃度對鎖陽總黃酮提取率的影響在提取2次,提取功率540W,料液比1∶30,提取溫度75℃,超聲提取時(shí)間1h條件下,考察乙醇濃度對鎖陽總黃酮提取率的影響(圖見1)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,乙醇濃度從30%增加到70%的過程中,提取率逐漸增大,至70%時(shí)達(dá)最大值,隨后減小,故選擇乙醇濃度為70%。2.2.2超聲提取次數(shù)的確定在乙醇濃度70%,超聲功率540W,料液比1∶30,提取溫度75℃,超聲提取時(shí)間1h條件下,考察提取次數(shù)對鎖陽總黃酮提取率的影響(見圖2)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,提取次數(shù)從1次增加到2次,提取率升高幅度較明顯,繼續(xù)增加提取次數(shù),提取率無明顯的提高,故選擇提取次數(shù)為2次。2.2.3超聲功率的影響在乙醇濃度70%,提取2次,料液比1∶30,提取溫度75℃,超聲提取時(shí)間1h條件下,考察超聲功率對鎖陽總黃酮提取率的影響(見圖3)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,超聲功率在240W~600W時(shí),提取率隨超聲功率的增大而升高,600W時(shí)提取率達(dá)到最高,故選擇超聲功率為600W。2.2.4料液比對鎖陽總黃酮提取率的影響在乙醇濃度70%,提取2次,超聲功率600W,提取溫度75℃,超聲提取時(shí)間1h條件下,考察料液比對鎖陽總黃酮提取率的影響(見圖4)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,料液比(g:mL)在1:6~1:30范圍內(nèi),提取率逐漸增大,之后隨料液比的繼續(xù)增大而略有下降,故選擇提取料液比為1∶30。2.2.5提取溫度對鎖陽總黃酮提取率的影響在乙醇濃度70%,提取2次,超聲功率600W,料液比1∶30,超聲提取時(shí)間1h條件下,考察提取溫度對鎖陽總黃酮提取率的影響(見圖5)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,提取溫度從50℃升高75℃過程中,提取率也隨之逐漸增大,在75℃時(shí)達(dá)最高值,而后隨溫度的繼續(xù)升高而略有下降,故選定提取溫度為75℃。2.2.6超聲提取時(shí)間在乙醇濃度70%,提取2次,超聲功率600W,料液比1∶30,提取溫度75℃,考察超聲提取時(shí)間對鎖陽總黃酮提取率的影響(見圖6)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,超聲提取時(shí)間從30min增加到60min,提取率增大,而后隨時(shí)間的繼續(xù)增加反而下降,故選擇超聲提取時(shí)間為60min。2.3試驗(yàn)計(jì)劃和結(jié)果2.3.1黃酮提取率測定通過Design-Expert軟件,根據(jù)Box-benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,綜合單因素考察結(jié)果,選取乙醇濃度(X1)、料液比(X2)、提取溫度(X3)、超聲提取時(shí)間(X4)四個(gè)因素,以總黃酮提取率(Y)為衡量指標(biāo)。采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),分析因素與設(shè)計(jì)見表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。2.3.2方差分析及信度分析利用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,各因素經(jīng)回歸擬合后,得回歸方程為:Y=28.50-0.0079X1-0.053X2+1.9X3+0.70X4-1.22X1X2-0.64X1X3-0.091X1X4-0.39X2X3+1.04X2X4-0.11X3X4-1.83X12-1.64X22-2.60X32-2.87X42。對優(yōu)化后的回歸模型進(jìn)行方差分析及可信度分析(見表3)。結(jié)果顯示,該模型顯著(P<0.0001)且R2=0.9945,表明該模型擬合較好;變異系數(shù)(C.V.%)為1.00%,說明實(shí)驗(yàn)有良好的穩(wěn)定性。綜合分析表明可用此模型來分析和預(yù)測超聲提取鎖陽總黃酮的工藝結(jié)果。方差分析結(jié)果表明,提取溫度和超聲時(shí)間對鎖陽總黃酮提取率影響顯著,而乙醇濃度和料液比的影響較小,得到各因素的主效應(yīng)關(guān)系為:提取溫度>超聲提取時(shí)間>液料比>乙醇濃度。2.3.3提取時(shí)間的影響為了更直觀的觀察其中兩個(gè)因素同時(shí)對總黃酮提取率的影響,進(jìn)行降維分析,利用多元回歸方程可以得到不同因素對提取率率影響的響應(yīng)面及其等高線圖(見圖7~9)。由響應(yīng)面圖可知,響應(yīng)面開口向下,隨著每個(gè)因素的增大,響應(yīng)值增大,當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后,隨著因素的增大,響應(yīng)值逐漸減小。該模型有穩(wěn)定點(diǎn),且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。比較三組圖可得:超聲提取時(shí)間對黃酮提取率的影響較為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡(等高線排列密集),提取時(shí)間最佳值在63min附近,而乙醇濃度與料液比對黃酮提取率的影響不大,表現(xiàn)為曲線較為平滑(等高線排列疏松),隨其數(shù)值的增加或減少,響應(yīng)值沒有顯著性變化,其最佳值分別在70%和1∶30左右。從等高線圖可以看出,乙醇濃度與料液比、料液比與超聲提取時(shí)間之間的交互作用顯著;而乙醇濃度與超聲提取時(shí)間之間的交互作用不顯著。說明乙醇濃度、料液比和超聲提取時(shí)間對鎖陽總黃酮提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系,平方項(xiàng)和交互項(xiàng)也有很重要的作用,這與方差分析結(jié)果相一致。分析圖8可知:料液比與提取時(shí)間的等高線存在上升嶺系統(tǒng)。料液比較小時(shí),等高線相對比較平坦,提取時(shí)間對總黃酮得率影響不明顯;料液比較大時(shí),等高線排列密集,提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響比較明顯。且通過上升嶺系統(tǒng)可以較快地到達(dá)提取率最優(yōu)區(qū)域。說明兩個(gè)因素之間存在互相促進(jìn)作用,與回歸方程中交互項(xiàng)X2X4的系數(shù)為正號相符。圖7則剛好相反,說明乙醇濃度與料液比之間有一定的抑制作用。2.3.4最佳工藝條件的確定通過Design-Expert得最佳工藝條件為:乙醇濃度為69.64%,料液比為1∶30.01,提取溫度為76.93℃,超聲提取時(shí)間為61.75min,在此工藝條件下,提取率理論值可達(dá)28.918%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性,同時(shí)考慮實(shí)際操作和儀器的局限性,將最佳工藝條件修正為:乙醇濃度70%;料液比1:30;提取溫度77℃;超聲提取時(shí)間62min。并進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得鎖陽總黃酮平均提取率為28.851%(RSD=2.07%,n=5),與理論值吻合較好,表明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。3最佳工藝的確定超聲波提取法由于操作簡便快捷、提取溫度低、提取率高、提取物的結(jié)構(gòu)未被破壞等特點(diǎn),甚至有時(shí)會比超臨界萃取、微波萃取等現(xiàn)代提取方法效果更好,近年來已廣泛用于植物有效成分的提取。響應(yīng)面法集統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)學(xué)建模和計(jì)算機(jī)科學(xué)于一身,隨著計(jì)算機(jī)的發(fā)展,它已成為精度高、應(yīng)用廣并具有實(shí)用價(jià)值的優(yōu)化技術(shù)。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),建立了超聲提取鎖陽總黃酮的工藝數(shù)學(xué)模型?；貧w分析表明,