植物抗線蟲基因工程的分子標(biāo)記

植物線蟲是植物的一個(gè)重要領(lǐng)域。根據(jù)美國科學(xué)家的統(tǒng)計(jì)，世界每年的損失可達(dá)1000億美元。解決植物線蟲危害的主要途徑之一是培育抗線蟲植物新品種。研究發(fā)現(xiàn),自然界一些植物中存在抗線蟲基因,如番茄、甜菜和小麥等,目前一部分抗線蟲基因已被克隆,一部分不久將會被克隆和鑒定。標(biāo)記和克隆這些基因,并在分子水平上對其進(jìn)行遺傳操作與以利用,能大大加速育種的進(jìn)程,具有廣闊的應(yīng)用前景。1種植物的寄生蟲嚴(yán)重危害植物的線蟲類群較多,如根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、滑刃線蟲、莖線蟲、粒線蟲及短體(根腐)線蟲等,而根結(jié)線蟲(Meloidogynespp)和胞囊線蟲(Heterodera和Globodera)是危害最嚴(yán)重的兩大類。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上危害最重的根結(jié)線蟲有4個(gè)種,即南方根結(jié)線蟲(Meloidogynincognita)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)、北方根結(jié)線蟲(M.hapla)和花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)。它們的寄生范圍很廣,主要危害茄科、葫蘆科、花生等多種植物。胞囊線蟲是另一類危害較重的線蟲,主要有大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)、甜菜胞囊線蟲(H.schachtii)、燕麥胞囊線蟲(H.avenae)、馬鈴薯金線蟲(Globoderarostochiensis)、馬鈴薯白囊線蟲(G.pallida)。它們的共同點(diǎn)是都危害根系,造成根系衰弱,發(fā)育不良,甚至腐爛,導(dǎo)致地上部生長衰弱、矮化、葉片變黃、開花少,甚至全株枯死,嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。隨著人們環(huán)保意識的加強(qiáng),應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥防治作物的線蟲病愈來愈受到限制,提高作物自身的抗病性防治病害是一種既經(jīng)濟(jì)又有效的措施,倍受人們的關(guān)注。2抗線蟲基因的分子標(biāo)記、定位和克隆2.1抗作體體中的基因表達(dá)德國科學(xué)家對甜菜的抗病育種做出了巨大的貢獻(xiàn),尤其是在抗甜菜胞囊線蟲(H.schachtiiSchm.)研究方面成績顯著。1992年,Jung等用抗線蟲野生甜菜(Betapatellaris)和栽培品種進(jìn)行雜交,對抗性基因進(jìn)行了分子標(biāo)記;采用染色體特異性質(zhì)粒文庫方法,建立一種高密度不連續(xù)RFLP植物基因組圖譜。通過幾年不斷的努力,在1997年Cai等克隆出了第1個(gè)抗甜菜胞囊線蟲基因-Hs1pro-1,通過特異基因組衛(wèi)星標(biāo)記和基因組斷裂點(diǎn)分析進(jìn)行克隆。相應(yīng)的cDNA通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)和CaMV35s啟動(dòng)子控制下在甜菜根中進(jìn)行了表達(dá)。在這種抗性品種中很少觀察到線蟲的雌蟲。其對線蟲的抗性主要表現(xiàn)為雌蟲不能完成生活史,也不能產(chǎn)卵,被線蟲取食的合胞體很小,與正常的合胞體明顯不同。Hslpro-1基因在根中表達(dá)產(chǎn)物是282個(gè)氨基酸序列,不完全富含亮氨酸重復(fù)序列跨膜片段,這和以前克隆的抗病基因的特征相似。有關(guān)抗性基因在栽培品種中的檢測技術(shù)和抗性基因在植物中高效表達(dá)的規(guī)律也有了深入的研究。不久,抗線蟲甜菜將會應(yīng)用于生產(chǎn)。2003年Cai等從甜薯的塊根中分離出一種貯存蛋白基因(SpTI-1),它是一種Kunitz型胰蛋白抑制劑,具有抗昆蟲取食的能力,并已在轉(zhuǎn)基因煙草和花椰菜中得到驗(yàn)證。為了證實(shí)它是否對甜菜胞囊線蟲具有抗性,他們采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系,將其轉(zhuǎn)入到栽培甜菜(BetavulgarisL.)中,通過Northern和Western雜交分析在所有的轉(zhuǎn)化體中都有SpTI-1基因存在,12個(gè)轉(zhuǎn)化的發(fā)根中有8個(gè)表現(xiàn)出對甜菜胞囊線蟲有強(qiáng)烈的抑制作用。這種抑制不與表達(dá)的蛋白量有關(guān)、而和胰蛋白抑制劑的作用機(jī)理有關(guān),但也不完全相同。相關(guān)的數(shù)據(jù)表明,胰蛋白抑制劑的活性是抑制甜菜胞囊線蟲的關(guān)鍵因子,這一研究為甜菜胞囊線蟲的治理提供了新的有效的抗取食的基因類型。2.2抗其他抗種基因番茄中的抗線蟲基因—Mi是通過種間雜交胚胎挽救法(embryorescue)從野生種(Lycoperisiconperuvianum)導(dǎo)入栽培番茄種(L.esculentum)中的。Mi基因是單個(gè)顯性或半顯性的抗性基因。Aarts等通過染色體步查法對來源于野生番茄抗根結(jié)線蟲(M.incognita)基因Mi進(jìn)行了分子標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)與編碼酸性磷酸酯酶(acidphosphatase)的Aps-1基因相連鎖并定位在6號染色體。Tanaka等對Aps-1基因進(jìn)行克隆,并鑒定了部分序列。由于Aps-1與Mi基因連鎖,Cap等用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)測定酸性磷酸同功酶的活性篩選抗線蟲基因Mi。1998年,對抗線蟲基因的研究有了重大突破,Kaloshian等和Milligan等用定位克隆得到Mi基因,與其他已克隆的植物抗病基因具有相似性,即Mi編碼的蛋白具有NBS(nucleotidebindingsite)和LRR(leucinerichrepeat)結(jié)構(gòu)。Mi-1是廣譜抗性基因,既抗根結(jié)線蟲又抗馬鈴薯蚜蟲(Macrosiphumeuphorbiae),同樣位于6號染色體上的耐熱抗線基因Mi-9也被定位和鑒定。番茄中的另一個(gè)抗線蟲基因Hero定位在番茄的4號染色體上。它也是一個(gè)廣譜抗性的基因,既抗馬鈴薯金線蟲又抗馬鈴薯白胞囊線蟲。2002年,Ernst等克隆了此基因,并對編碼的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)也具有NBS和LRR結(jié)構(gòu),與其它抗性基因的產(chǎn)物相似。Nombela等研究發(fā)現(xiàn)Mi-1.2是多抗性基因。我們知道它抗根結(jié)線蟲的同時(shí)還抗馬鈴薯蚜蟲,現(xiàn)又顯示出抗煙粉虱(Bemisiatabaci)的特性,是唯一的具有同時(shí)抗3種不同生物的基因。故而Mi基因在有害生物的綜合治理中有重要的應(yīng)用價(jià)值。2.3iii染色體上的工商型及遺傳距離的確定抗馬鈴薯金線蟲基因Gro1位點(diǎn)用限制長度多態(tài)性(RFLP)進(jìn)行了分子標(biāo)記。1996年Ballvora用RFLP、AFLP和RAPD對位于VII染色體上Gro1位點(diǎn)進(jìn)行了精確定位,獲得3個(gè)RFLP標(biāo)記和1個(gè)RADP標(biāo)記,在Gro1附近2個(gè)AFLP標(biāo)記的遺傳距離分別是0.6cM和0.8cM?？柜R鈴薯白囊線蟲基因Gpa2通過定位的策略被克隆了出來。該基因和抗馬鈴薯X病毒的基因Rx1的蛋白序列有很高的同源性,均位于XII號染色體上?？柜R鈴薯線蟲的基因H1用RFLP標(biāo)記等位基因進(jìn)行PCR分析診斷時(shí),發(fā)現(xiàn)與Grol基因緊密相連,H1基因能導(dǎo)致馬鈴薯被取食部位的壞死。2.4小麥抗胞囊線蟲基因的鑒定危害小麥的線蟲有燕麥胞囊線蟲、根腐線蟲(Pratylenchusneglectus)和小麥粒癭線蟲(Anguinatritici)等。對小麥抗線蟲基因研究較多的是澳大利亞和美國。1996年,Williams等通過標(biāo)簽Tag605探針鑒定出小麥抗胞囊線蟲的基因位于品種AUS10894染色體2B上7cM處。抗小麥胞囊線蟲基因Cre-3是通過作圖法克隆的,它位于小麥染色體2D的長臂上,物理圖譜距離為0.06cM。它編碼的氨基酸有NBS和LRR結(jié)構(gòu),屬于抗病基因的成員且在根中特異表達(dá)。在小麥中尋找抗性基因一直是抗病育種者的夢想,應(yīng)用RGAs(Resistancegeneanalogs)法對抗線蟲基因CreX在小麥中進(jìn)行了定位。小麥中的另一個(gè)抗根腐線蟲基因Rlnn1采用AFLP進(jìn)行分子標(biāo)記并定位在7A染色體上。另外幾個(gè)抗性位點(diǎn)Cre1定位于2B染色體上。Cre2和Cre5是來自不同的抗源也分別標(biāo)記在不同的染色體上。這對今后的小麥育種有重要的意義。2.5ssr標(biāo)記的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)和基因連鎖大豆胞囊線蟲(H.glycines)是大豆生產(chǎn)上的一種主要病原物,運(yùn)用大豆抗性基因的分子標(biāo)記和克隆技術(shù)極大地促進(jìn)了大豆抗病育種的進(jìn)程。Mahalingam等以Excess×Peking的F2為材料,利用3個(gè)形態(tài)標(biāo)記、108個(gè)RFLP標(biāo)記和400個(gè)RAPD標(biāo)記對大豆胞囊線蟲3號小種抗性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,控制顏色(黑色)的i位點(diǎn)與3號小種的抗性基因Rhg4緊密連鎖,相距僅0.6cM;另2個(gè)RFLP標(biāo)記pA85a(連鎖群A)、pA136(連鎖群C)和3個(gè)RAPD標(biāo)記E01(連鎖群A)、G15d(連鎖群F)和S07a(連鎖群A)也不同程度的與抗病基因連鎖。由此推斷,3號小種的抗性受多個(gè)基因控制,屬數(shù)性狀遺傳,而且每個(gè)基因位點(diǎn)的作用程度均不相同。Conciliido等以PI209332為抗源材料,也發(fā)現(xiàn)i位點(diǎn)與3號小種的抗性位點(diǎn)連鎖。Concibido等通過對4個(gè)最廣泛使用的抗源PI209332、PI90763、PI88788和Peking的分析,找到了4個(gè)與抗3號生理小種有關(guān)的數(shù)量特征位點(diǎn)(QRL),其中Rhg1的最為重要,因?yàn)樵谶@幾個(gè)抗性品種中都有此位點(diǎn)存在。此點(diǎn)是屬于非小種抗性。這對抗線基因的克隆和大豆抗病育種有重要的意義。Meksem等將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為STS標(biāo)記,從10個(gè)AFLP中得到6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)標(biāo)記,與rhg1和Rhg4的位點(diǎn)相連鎖的分子標(biāo)記已被確定。Lewers用BAC文庫和PCR方法對抗大豆胞囊線蟲的主效基因Rhg4給予了精確的定位。Rhg4與影響大豆種皮的基因位點(diǎn)i和編碼AK-HSDH(aspartokinasehomoserinedehydrogenase)的位點(diǎn)相鄰。因?yàn)榇蠖箤Υ蠖拱揖€蟲的抗性是受多個(gè)基因位點(diǎn)控制,遺傳規(guī)律復(fù)雜,雖然有較多的研究,但沒有突破性的進(jìn)展,相信隨著研究的深入,謎底最終會被解開。2.6抗線與rflp的分子標(biāo)記在花生中,花生根結(jié)線蟲引起嚴(yán)重病害,來自Arachiscardenasii的兩個(gè)主效基因Mae和Mag可減少蟲卵數(shù)量或限制結(jié)節(jié)的形成,這兩個(gè)基因已被證實(shí)與RAPD、序列特征性擴(kuò)增區(qū)域SCAR和RFLP位點(diǎn)緊密相連,這是花生中第1個(gè)有關(guān)抗線基因的分子標(biāo)記。在大麥中,抗線蟲(H.avenae)基因Ha1和Ha2(等位基因Ha3)已經(jīng)被定位到2號染色體上。另一新的基因Ha4被定位到5號染色體上。在辣椒中,抗根結(jié)線蟲的基因Me3和Me4也進(jìn)行了精確定位,它們緊密連鎖且具有熱穩(wěn)定性。3抗線蟲基因的克隆依據(jù)已克隆的抗線蟲基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)它們有一些與其它R基因(Resistancegene)所據(jù)有的共同特征。如第1個(gè)被克隆出來的抗線蟲基因Hs1pro1有LRR和NBS結(jié)構(gòu),Mi-1和Cre3其結(jié)構(gòu)特征相似(表1)。通過大量的遺傳學(xué)分析,LRR與蛋白質(zhì)之間的相互識別有關(guān)。Hwang等對Mi編碼蛋白的LRR進(jìn)行了研究,表明這種結(jié)構(gòu)與抗病信號傳導(dǎo)有關(guān),即與線蟲的識別相關(guān),證明其有調(diào)節(jié)局部細(xì)胞程序化死亡的作用。許多蛋白質(zhì)中的NBS具有ATP或GTP結(jié)合活性,說明其在蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸中改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象,從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的識別。已克隆的抗線蟲基因都是用定位克隆(positionalcloning)的,如Mi-1、Cre3、Gpa2和Hs1pro1的克隆。既然它們都有共同的結(jié)構(gòu)特征,我們便可利用它來克隆新的基因。Leister等根據(jù)煙草N基因和擬南芥中RPS2基因的保守序列設(shè)計(jì)PCR引物,對馬鈴薯DNA進(jìn)行擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物是與已知抗性基因有同源性,而且與抗線蟲基因位點(diǎn)Gro1和R7連鎖。Bakker等根據(jù)馬鈴薯抗線蟲基因Gpa2和抗馬鈴薯X病毒基因Rx1的LRR保守序列設(shè)計(jì)特異引物,獲得9個(gè)抗性基因相似物(RGHs)均定位于在馬鈴薯XII染色體上,與Gpa2和Rx1相似率達(dá)93%~95%。Hunger等利用R基因的保守序列設(shè)計(jì)引物,從甜菜中分離出的47個(gè)抗性基因類似物(RGAs),其中有一類似物與Hs1pro-1相似。這種抗病基因類似序列(resistancegeneanalogs,簡稱RGAs)法,是克隆R基因的新思路,比定位克隆法簡單直接。但得到R基因類似序列,并不等于得到了R基因,還要進(jìn)一步檢測這些序列與抗病性的共分離情況,從中得到R基因。4抗線蟲基因的分子標(biāo)記和克隆在植物線蟲的綜合治理中,種植抗性品種是防治植物線蟲的一種簡單而有效的措施。但是,目前許多作物中尚找不到合適的抗源材料,如葫蘆科作物。正是由于抗線蟲基因的克隆,為無抗源的作物抗線蟲育種提供了機(jī)遇。然而,并不是所有的抗線蟲基因