基于非培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建殺線蟲蛋白酶基因宏基因組fosmid克隆pro12

土壤環(huán)境中存在著巨大的微生物遺傳資源。然而,環(huán)境樣品中,超過99%的微生物不能用純培養(yǎng)的方法獲得。因而,多數(shù)的微生物不能夠被描述,阻礙了對微生物群體結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能的研究,以及微生物基因資源的挖掘和利用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,PCR技術(shù)的應(yīng)用,通過構(gòu)建基因克隆文庫和質(zhì)粒文庫,一些有用的基因及所編碼的代謝產(chǎn)物被篩選出來,然而,這些基因是基于已知序列信息的基礎(chǔ)上的,事實上,大多數(shù)的微生物基因序列信息是未知的。因此,可供挖掘利用的微生物功能基因極其有限,為了克服這些局限,一項新的技術(shù),宏基因組技術(shù),在20世紀(jì)90年代后期開始發(fā)展起來。宏基因組是對整個環(huán)境樣品的微生物群體的基因組分析。這一概念最初是由Handelsman提出。根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是植物根系專性內(nèi)寄生物。在世界范圍內(nèi),每年導(dǎo)致1000億美元的損失。近年來,隨著我國溫室蔬菜種植面積的擴大,蔬菜根結(jié)線蟲病的發(fā)生逐年加重,嚴(yán)重地產(chǎn)量損失達(dá)30%-50%,成為溫室蔬菜生產(chǎn)的一大障礙。目前,微生物蛋白酶被認(rèn)為是線蟲致病的毒力因子。研究表明微生物蛋白酶通過降解宿主外層保護屏障,侵染宿主。然而,之前的研究都是基于可培養(yǎng)的微生物,對不可純培養(yǎng)的微生物研究較少?；诖?我們直接從溫室線蟲發(fā)生地黃瓜根圍土壤取樣,構(gòu)建宏基因組Fosmid文庫,通過對文庫進行殺線蟲蛋白酶基因篩選,篩選到1個殺線蟲蛋白酶基因,并對基因結(jié)構(gòu)進行了初步分析。1材料和方法1.1材料表面1.1.1方法與試劑超低溫離心機(Sigma,Type:3k15),PCR儀(BIO-RAD,ALS-1296),凝膠成像儀(BIO-RAD,76S/06413),普通水平電泳儀(BIO-RAD,PAC3000),顯微成像儀(OLYMPUS,SZX12);文庫構(gòu)建用的Fosmid試劑盒:CopyControlTMHTPFosmidLibraryProductionKit),FosmidDNA提取用試劑盒:FosmidMAXTMDNAPurificationKit,均購自美國EPI公司(Epicentre,USA);引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。1.1.2樣品的采集和預(yù)處理土樣于2008年3月采集自海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗農(nóng)場黃瓜種植地。種植黃瓜年限10年以上。采樣地選擇10個種植黃瓜的地塊。土壤樣品采用五點采樣法,用土壤采樣器采集5個黃瓜根圍(采集直徑10cm)的土壤樣品,采集深度為0-15cm,混合后用密封袋帶回,土樣用10mesh(2mm)篩網(wǎng)過篩,去除小顆粒的石頭和殘存的植物根系,存放于-20℃冰箱中。土壤性質(zhì)見表1。1.1.3引用：表2顯示了細(xì)菌、放線菌、古菌和真菌的一般引用1.2nywelld-nzoslo,norw-1,10參考Bertrand等有所改進。含微生物細(xì)胞的沉淀用10mL0.8%NaCl重懸后,補上10mL的PVPP,渦旋混勻,10000×g,4℃離心10min后棄上清,重復(fù)3-5次,至上清呈淡褐色,沉淀用10mL0.8%NaCl重懸。將10mLNycodenz(Axis-Shield,Oslo,Norway;8gNycodenz溶于10mL滅菌水)加入懸液底部,11000×g,4℃離心30min。小心收集在Nycodenz-土壤混合顆粒和上層水層分界面上的白色細(xì)胞層,重懸后在10000×g4℃離心20min去除Nycodenz溶液。緊接著用蛋白酶K—溶菌酶—SDS法提取土壤DNA,用100μLTE溶解,1%瓊脂糖電泳檢測,-20℃保存。1.3fosmidfolmid文檔的構(gòu)建1.3.1dna電泳檢測Nycodenz密度梯度離心法提取的粗DNA經(jīng)低熔點瓊脂糖電泳(4℃,25V,8h),溶膠酶法回收主帶,脈沖場電泳檢測DNA分子量大小(0.1-40s,6V/cm,16h)。1.3.2低熔點瓊脂糖脈沖電泳按照Epicenter公司CopyControlTMHTPFosmidLibraryProductionKit的使用說明對DNA片段進行末端補平,然后再進行一次低熔點瓊脂糖脈沖電泳(0.1-40s,6V/cm,16h),切取25-48kb之間的條帶,溶膠酶法回收DNA,連接,包裝,轉(zhuǎn)導(dǎo)入EPI300宿主細(xì)胞中,涂到含12.5mg/L氯霉素的LB平板上。1.3.3菌株的培養(yǎng)用無菌牙簽將平板上的單菌落挑至96孔板,每個菌落一個孔,每孔加入150μL含12.5mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基,用膜封口,37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。1.3.4質(zhì)粒提取和克隆穩(wěn)定性檢測插入片段大小檢測:隨機挑取13個克隆,根據(jù)Fosmid文庫構(gòu)建試劑盒的說明書對其進行誘導(dǎo)培養(yǎng),使其獲得高拷貝質(zhì)粒,按照FosmidMAXTMDNAPurificationKit使用說明提取質(zhì)粒DNA,然后用NotI酶切,脈沖電泳檢測插入片段大小?？寺》€(wěn)定性檢測:隨機挑取5個克隆,分別接種于1mL含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)6d,分別提取第0代(第1天)和第100代(第6天)細(xì)菌培養(yǎng)物中的質(zhì)粒DNA,EcoRⅠ酶切后,電泳檢測。文庫中包含的微生物物種多樣性檢測:從文庫中隨機抽取138個克隆進行單末端測序,然后進行BLAST比對,檢測比對結(jié)果的重復(fù)度。1.4酶基因的篩選1.4.1級池區(qū)每個96孔板包含8行,12列。構(gòu)建二級池時,將保存好的96孔板中8行轉(zhuǎn)接到新的96孔板中的同一行,12列轉(zhuǎn)接到另外一個新96孔板中同一列,并補上150μL含12.5mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過夜。這樣就形成了42個8合1板和27個12合1板。即二級池。將8合1板中同一行的克隆保存到一塊新的96孔板中的同一個孔(方法同保存8合1或12合1),這樣就形成了4塊96合1克隆板,即超級池。1.4.2蛋白酶基因檢測將Fosmid克隆接種于LB固體培養(yǎng)基(含1%脫脂奶,12.5mg/L氯霉素)上,37℃,培養(yǎng)48h,通過觀察菌落周圍是否有透明圈來確定該克隆是否含蛋白酶基因。1.5lb固體培養(yǎng)基提取FosmidDNA,經(jīng)EcoRⅠ和SPhⅠ雙酶切后,膠回收1.5—5kb大小的片段,連接到用相應(yīng)的酶酶切后的pUC19載體上,轉(zhuǎn)化(用E.coliDH5α)后,涂板于LB固體培養(yǎng)基(含50mg/L氨芐青霉素)上,37℃,12h后,挑取盡量多的亞克隆,37℃,搖菌培養(yǎng)12h,將亞克隆轉(zhuǎn)接到LB固體培養(yǎng)基(含1%脫脂奶,50mg/L氨芐青霉素)上,37℃,16h后,將周圍產(chǎn)生透明圈的亞克隆挑出,37℃,搖菌培養(yǎng)12h,加上終濃度為15%的甘油,-20℃冰箱保菌備用。1.6線蟲處理與生物測定以根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)為靶標(biāo),按照Huang等的方法稍作修改,進行殺線蟲生物測定試驗。將保存好的亞克隆菌液從-20℃冰箱中取出,待其融化后,取1μL,接種于裝有50mL液體LB培養(yǎng)基的100mL三角瓶中,28℃,240r/min,培養(yǎng)4d后,取出,4℃,8000×g離心10min,收集上清。上清液分成兩部分,一部分直接處理線蟲,一部分高溫?zé)崽幚?100℃,25min)后作用于線蟲。生物測定試驗在12孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中進行,每孔2mL處理液,200-300頭線蟲,在顯微成像儀下觀察死亡的線蟲數(shù)。試驗5次處理(陽性對照阿維菌素(Abamectin),發(fā)酵上清液,熱處理發(fā)酵上清液,陰性E.coli對照和LB培養(yǎng)基對照),每處理至少3次重復(fù)。1.7數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建提取克隆espro124a5質(zhì)粒,送北京諾賽諾賽基因組研究中心測序。序列分析在生物學(xué)軟件DNAman和DNAstar中進行。亞克隆中包含的基因數(shù)和核酸序列運用在線分析頁面(/berry.phtml?topic=fgenesb&group=help&subgroup=gfindb)進行預(yù)測其是否含有獨立的啟動子,同時,進入網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(http://merops.sanger.ac.uk),對蛋白酶進行分類和鑒定。2結(jié)果和分析2.1原位裂解法結(jié)合PVPP預(yù)處理和Nycodenz密度梯度離心法提取的微生物基因組DNA純度高,跟直接原位裂解法提土壤DNA相比較,能有效去除土壤腐殖酸,有機質(zhì)等。并分別以細(xì)菌、放線菌、古菌和真菌通用引物(表2)進行PCR擴增,均擴增出各自的rDNA目的條帶說明純度上能夠達(dá)到構(gòu)建基因組文庫的要求。2.2fosmid文檔的構(gòu)建和資源分析2.2.1土壤微生物dna結(jié)構(gòu)間接法提取純化后的DNA在23-97kb之間有明顯分布,而Fosmid質(zhì)粒對插入片段大小的要求一般為40kb左右,所以所提DNA無需機械打斷即符合建庫要求。此外,相比于單一物種的基因組DNA,土壤微生物DNA主帶并不明顯集中于某一長度區(qū)域,而是分布在較大的范圍內(nèi),這可能有兩方面的原因:其一,不同物種的基因組DNA大小不一;其二,提取過程中機械損傷造成DNA斷裂。2.2.2土壤微生物aca的缺失產(chǎn)物,多表現(xiàn)在土壤微生物的t用NotⅠ進行酶切發(fā)現(xiàn),所有克隆在6.5-9.4kb之間有一條8.2kb的載體條帶,而插入片段呈大小不同的多個片段,這可能是土壤微生物DNA上的NotⅠ酶切位點較多的原因。文庫包含31008個克隆,根據(jù)所使用的pCC2FOS質(zhì)粒插入片段大小為40kb左右,估計該文庫所覆蓋的基因組大小超過1Gb。2.2.3克林波特穩(wěn)定性試驗第100代酶切圖譜與第0代的無任何明顯差異,沒有發(fā)現(xiàn)插入片段的丟失或重排,說明所構(gòu)建的Fosmid文庫是穩(wěn)定的。2.2.4微生物物種數(shù)量138個隨機末端測序結(jié)果中,有6個分別比對上黃單胞菌、新月柄桿菌、漢堡硝化桿菌、Parvibaculumlavamentivorans、茄科雷爾氏菌和苜蓿中華根瘤菌,4個比對上熒光假單胞桿菌。共10個比對上了同源序列,占7.25%。無同源序列的克隆共128個,占到92.75%。這表明該文庫富含大量未知微生物物種。其次,10個比對上同源序列的都是細(xì)菌序列,這可能是有兩方面的原因,其一,細(xì)菌是該環(huán)境樣品的優(yōu)勢菌群,其物種豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于古菌、真菌以及其他微生物;其二,間接提取DNA的方法得到細(xì)菌比例更大一些。此外,由測序結(jié)果分析該文庫的空載率僅為1.2%,隨機性為1.000。部分BLAST比對結(jié)果見表3。2.3pro12周圍透明圈以脫脂奶為底物,將超級池和二級池中的Fosmid克隆轉(zhuǎn)接到LB脫脂奶板上,37℃,培養(yǎng)48h后,發(fā)現(xiàn)克隆pro12周圍有明顯透明圈(圖1)。經(jīng)反復(fù)驗證,克隆pro12周圍均有透明圈,而其他克隆周圍無透明圈存在,說明pro12中含蛋白酶基因。2.4lb固體培養(yǎng)基提取Fosmid克隆pro12的DNA,經(jīng)EcoRⅠ和SPhⅠ雙酶切后,膠回收1.5—5kb大小的片段(圖略),連接到用相應(yīng)的酶雙酶切后的pUC19載體上,轉(zhuǎn)化(用E.coliDH5α)后,涂板于LB固體培養(yǎng)基(含50mg/L氨芐青霉素)上,37℃,12h后,挑取盡量多的亞克隆,37℃,搖菌培養(yǎng)12h,將亞克隆轉(zhuǎn)接到LB固體培養(yǎng)基(含1%脫脂奶,50mg/L氨芐青霉素)上。經(jīng)篩選,克隆espro124a5能夠降解脫脂奶(圖2)。說明克隆中含有目標(biāo)蛋白酶基因。2.5研究的結(jié)果與討論結(jié)果顯示(表4,圖3),亞克隆espro124a5對靶標(biāo)線蟲Meloidogynespp.具有較大的殺線蟲活性。在生物測定中,線蟲的致死率4h、8h、12h后的觀測結(jié)果分別為80%,99%和100%。12h后,能夠看到被破壞的線蟲角質(zhì)。在所有陰性對照:陰性對照菌E.coli,LB液體培養(yǎng)基和培養(yǎng)物上清液煮沸25min,12h后,致死率下降到25%以下,并且這些對照中,死亡線蟲的角質(zhì)完好無損。熱處理上清液對線蟲無活性,說明基因編碼的蛋白對線蟲起了一定的作用。表4中可以看出,espro124a5殺線蟲活性甚至強于陽性對照阿維菌素(Abamectin),說明蛋白酶espro124a5有較強的殺線蟲活性。2.6絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)編碼該蛋白酶的ORF序列全長1746個堿基,編碼581個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)分子量為61,353Da,G+C含量63.82%,等電點8.75,包含起始密碼子ATG和終止密碼子TAG(AccessionNo.GU556930atNCBI)。在其5′非編碼區(qū)無S-D序列(Shine-Dalgarno,SD),3′非編碼區(qū)無反向串聯(lián)重復(fù)序列(Tandeminvertedrepeatsequences)。在氨基酸序列中,23和24個氨基酸序列之間是其信號肽劈開位點。通過NCBI上blastx比對,發(fā)現(xiàn)espro124a5與來自于MaricaulismarisMCS10(accessionno.YP_75682.2atNCBI)的絲氨酸蛋白酶S15僅有45%的同源性,與另外一種不可純培養(yǎng)的Maricaulissp.(AccessionNo.ADD69818.1atNCBI)絲氨酸蛋白酶peptidaseS15僅有93%的同源性,是一種新型的絲氨酸蛋白酶,有其保守的催化三元組:Asp469,His541和Ser348。同時,espro124a5已在NCBI上登錄,并獲得核酸序列登錄號:GU556930。3宏基因組fosmid庫爾克氏體系的構(gòu)建及對其的形成在宏基因組途徑中,最重要的一步是環(huán)境樣品基因組DNA的提取。到目前為止,沒有一個簡單統(tǒng)一的方案適合提取所有的環(huán)境樣品DNA。主要問題是DNA的數(shù)量,純度,完整性和DNA的代表性。DNA的提取方法有兩種:要么,通過堿裂解法直接從環(huán)境樣品中提取;要么,間接法,先從環(huán)境樣品中分離和濃縮微生物細(xì)胞,然后再進行堿裂解提取環(huán)境樣品DNA。對許多環(huán)境樣品來說,間接法是十分可取的。如對海洋水來說,直接從其中分離DNA是不實際的,因為微生物密度較低,因此,在濃縮細(xì)胞之前,通常進行一些過濾的操作。對土壤樣品來說,許多土壤的污染是非常嚴(yán)重的,例如,多酚類物質(zhì)的污染能夠影響DNA的純化,也能影響宏基因組過程中隨后的步驟。Lindahl和Bakken報道用密度梯度分離液(Nycodenz)將微生物細(xì)胞分離出來,可以獲取基本上全部加入滅菌土中的測試細(xì)菌。據(jù)AcridineOrangeDirectCounts(AODC)方法估測,這種方法提取到的細(xì)菌細(xì)胞比單用洗滌/離心法得到的細(xì)胞提高了1%—50%,并且提取過程對細(xì)胞并不造成損傷。因此,為兼顧土壤DNA的純度和片段大小,本研究采取結(jié)合PVPP的Nycodenz密度梯度離心法提取溫室土壤微生物基因組DNA。先將分散的土壤懸液低速離心,去除大的土壤顆粒,然后高速離心收集上清中的細(xì)胞后,用PVPP洗滌1-3次,去除腐殖酸等雜質(zhì),最后,將細(xì)胞重懸液經(jīng)Nycodenz密度梯度離心去除其余的土壤碎片及雜質(zhì),最終得到了足量的純凈微生物細(xì)胞。實驗結(jié)果表明,通過該法提取到的DNA純度高、片段長,完全能滿足構(gòu)建宏