葛根總黃酮對糖尿病大鼠血管平滑肌細胞增殖及核因子-b的影響

糖尿?。╩e抑郁）是患者早期死亡和致死率的主要原因。糖尿病患者的死亡率也顯著高于非糖尿病患者。VSMCs的異常增殖遷移和表型改變是糖尿病慢性血管病變的主要病理學基礎,而血管平滑肌的異常增殖可能與核因子-κB激活有關。葛根總黃酮(Puerarialobataisoflavones,PLI)是從野葛Puerarialobata(wild.)Ohwi根中提取的有效成分,用于治療高血壓等心腦血管疾病,療效較確切。本實驗通過培養(yǎng)和建立糖尿病大鼠VSMCs模型,觀察葛根總黃酮對糖尿病大鼠VSMCs的增殖及NF-κB核轉移的影響,探討葛根總黃酮體外抗糖尿病血管病變作用。1材料和方法1.1試驗藥物葛根總黃酮(陜西森弗生物技術公司,純度80%,棕黃色粉末)。1.2動物清潔級SD大鼠,雄性,體重200～240g,由瀘州醫(yī)學院實驗動物科提供(合格證號:川醫(yī)動字2401115)。1.3免疫組織化學鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司,批號S0130);RPMI1640(GIBCO公司);胰蛋白酶(美國Sigma公司);胎牛血清(天津灝洋生物制品科技責任有限公司);CCK-8(碧云天生物技術研究所);免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);NF-κB激活-核轉運檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所);DAB顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司)。1.4年—儀器倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司,CKX41型);CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司,MCO-15AC型);超低溫冰箱(日本Sanyo公司,MDF-192型);酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司,DNM-9602型);激光共聚焦掃描顯微鏡(德國LEICA公司,TCSSP5型)。日本京都血糖儀(日本愛科來株式會社)。1.5方法1.5.1大鼠血糖模型的建立大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,pH4.5,0.1%枸櫞酸緩沖液新鮮配制)55mg/kg造糖尿病大鼠模型,72h后采用大鼠斷尾取血測血糖值,連續(xù)測3d。以血糖水平>16.7mmol/L為糖尿病建模成功。1.5.2中膜血管培養(yǎng)組正常大鼠和建模成功大鼠正常喂飼1個月后頸椎脫臼處死,75%酒精浸泡2～3min,在無菌環(huán)境中迅速取出胸主動脈,剝去血管外膜,去除內膜,取中膜血管平滑肌,剪成1.5～2.0mm3大小的組織塊,平鋪于培養(yǎng)瓶,加入含血清的RPMI1640,放人37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3d。倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。1.5.3sma免疫組織化學染色(1)用相差倒置顯微鏡觀察細胞。(2)SMA免疫組織化學染色:將細胞接種于置有小玻片的6孔板中,培養(yǎng)至細胞成致密單層后取出玻片,PBS沖洗后用冷丙酮固定.二步法進行SMA免疫組織化學染色。1.5.4計數(shù)細胞后復孔取生長良好的正常大鼠和糖尿病大鼠的VSMCs,胰酶消化后計數(shù),調整細胞為5×104/ml接種24孔板。24h后開始計數(shù)細胞,以后每隔24h計數(shù)一次,每次取3個復孔,連續(xù)計數(shù)7d,計算平均值。根據(jù)結果,以單位細胞數(shù)(細胞數(shù)/ml)為縱坐標,時間為橫坐標繪制正常組與糖尿病組的生長曲線。1.5.5根系總黃酮組細胞+培養(yǎng)基+藥物將96孔板分為空白(培養(yǎng)基)、陰性對照(細胞+培養(yǎng)基)、藥物對照(藥物+培養(yǎng)基)和(100、50、25、12.5、6.25、3.125)×10-5mol/L葛根總黃酮組(細胞+培養(yǎng)基+藥物)。取生長良好的糖尿病VSMC細胞,調濃度為1×105/L后接種于96孔細胞培養(yǎng)板,采用cck-8法測定相應的吸光度(absorbent,A)值,按公式(1-A實驗組÷A對照組)×100%得出不同濃度對應的抑制率,將劑量和抑制率代入LOGIT法藥物抑制濃度計算軟件1.0.0版按非線性回歸擬合計算出50%抑制率(IC50)。1.5.6血管平滑細胞+培養(yǎng)基調整VSMCs細胞濃度為1×105/L接種于6孔板中(板中事先放蓋玻片),培養(yǎng)1天待細胞貼壁,分別分為三組,正常組(正常大鼠血管平滑肌細胞+培養(yǎng)基);糖尿病組(糖尿病鼠血管平滑肌細胞+培養(yǎng)基);葛根總黃酮組(將不同濃度50、12.5、6.25×10-5μmol/L的葛根總黃酮加入糖尿病鼠血管平滑肌細胞+培養(yǎng)基)培養(yǎng)1天,按NF-κB激活-核轉運檢測試劑盒說明書進行操作。于波長450nm處在共聚焦顯微鏡下觀察細胞核、細胞漿顏色,拍照。2結果2.1胞質密度和生長隨途徑的變化倒置相差顯微鏡下單個平滑肌細胞呈梭形,扇形或三角形狀,有多個細胞突起,胞漿豐富,胞質密度高,不透明,核卵圓形居中,有多個核仁。細胞生長致密時平行排列成束,部分重疊,表現(xiàn)為旋渦狀生長,見圖1。經SMA免疫組織化學染色后,胞漿著色,呈陽性反應,高倍鏡下可見胞漿內大量棕色、與細胞長軸平行的纖維細絲,即平滑肌肌動蛋白絲,見圖2。2.2正常組和糖尿病組大鼠血管平滑肌生長曲線的比較可見兩者細胞增長程度與天數(shù)呈S型關系,但糖尿病組血管平滑肌生長速度比正常組快,結果見圖3。2.3劑量依賴關系50%抑制率葛根總黃酮可抑制糖尿病與正常VSMCs的增殖,且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關系,隨著濃度的增加,作用明顯增強,見表1。葛根總黃酮對糖尿病VSMCs增殖的抑制作用明顯強于正常VSMCs增殖,其A450、抑制率及IC50均有明顯差異,見表2。2.4糖尿病和正常組vsmcs胞質和根總黃酮的熒光染色VSMCs中NF-κB核轉位的影響正常組血管平滑肌細胞呈梭形,扇形或三角形狀,散在成簇生長,胞質中有中等強度紅色熒光著色,胞核為藍色熒光著色(圖4),糖尿病組VSMCs胞質中紅色著色稍減弱,胞核中紅色熒光著色強(圖5),葛根總黃酮組可見胞質中的紅色較糖尿病組強,正常組弱,胞核中紅色著色較糖尿病組弱,正常組強(圖6)。3nf-b對糖尿病大鼠vsmcs增殖的調控糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的危險性較正常人高3～4倍,糖尿病大血管并發(fā)癥是造成糖尿病病人殘疾和死亡的主要原因之一,最常見的表現(xiàn)就是發(fā)生動脈粥樣硬化,常累及大血管。VSMCs是動脈壁的主要成分,在血管內膜增生及血管重塑中起重要作用。糖尿病慢性血管病變的主要發(fā)病機制VSMCs增殖并遷移入內膜,同時產生過量的細胞外基質,導致纖維組織增生,最終形成斑塊或血拴。NF-κB是存在于細胞漿中的一種快反應轉錄因子,參與了動脈粥樣硬化的過程。研究顯示動脈粥樣硬化的VSMCs和巨噬細胞中都大量存在激活的NF-κB。RamanaKV等的研究直接證明了NF-κB調節(jié)VSMCs增殖的重要作用。NF-κB激活參與糖尿病血管病變也得到了證實:糖尿病時,在某些刺激因素如AGEs、氧化應激、脂代謝紊亂及細胞因子等的作用下,NF-κB被激活后即發(fā)生核轉位,P65亞基由胞質轉移至胞核,與特定基因啟動子或增強子上的特異性κB序列結合,調節(jié)基因轉錄,啟動血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)合成,促進單核細胞與血管內皮細胞的粘附,從而導致動脈粥樣硬化的發(fā)生。本研究觀察到體外培養(yǎng)糖尿病VSMCs生長速度明顯高于正常血管平滑肌,同時糖尿病大鼠VSMCs出現(xiàn)NF-κB的核轉移,提示糖尿