利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鹽角草基因nhx介導(dǎo)油菜抗卡那霉素植株的選育

土壤鹽分是世界農(nóng)業(yè)最嚴(yán)重的問題之一。世界上大約有3.4億公頃耕地受到鹽的威脅，占總耕地面積的4%。一般植物不能在高度鹽漬化土壤上正常生長的主要原因是高濃度的Na+對植物的毒害作用。離子毒害主要是由于植物攝取了過量的Na+,K+,Cl-等離子,使植物細(xì)胞內(nèi)離子濃度增高,而細(xì)胞內(nèi)許多酶卻只能在很狹窄的離子濃度范圍才具有活性。液泡膜中的一種Na+/H+反向運輸體可促進(jìn)離子在液泡中的分室效應(yīng),跨液泡膜的pH為其提供能量。Na+/H+運輸體存在于植物體最早是在多種植物液泡及囊膜的反向活性的生物化學(xué)研究中推斷出來的。Na+/H+運輸體屬于NHX家族成員,迄今為止在植物中克隆得到六個。其中NHX1及NHX2在植物中研究得較多。NHX基因功能現(xiàn)今有三大分支:(1)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)鹽分吸收,提高植物耐鹽能力。(2)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酸堿度,控制胞內(nèi)運輸。(3)促進(jìn)植株生物產(chǎn)量。在植物中,鹽離子從細(xì)胞質(zhì)以及液泡的分隔區(qū)排出是其調(diào)節(jié)滲透壓和消除鈉離子毒害的主要過程。首先由質(zhì)子(泵)提供鈉離子反電化學(xué)梯度穿過液泡膜和質(zhì)膜時所要動力。通過在功能上恢復(fù)Na+/H+反向運輸體(ScNHX1)缺陷型酵母突變體,從擬南芥中分離出了AtNHX1基因,并且與哺乳動物NHE反向運輸體具有序列相似性。在轉(zhuǎn)基因擬南芥和轉(zhuǎn)基因西紅柿中過量表達(dá)AtNHX1,可在液泡膜中積累大量的運輸體,并且極大地提高了它們的耐鹽性。這些結(jié)果顯示出AtNHX家族在鈉離子的液泡分室效應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。本文在前人研究的基礎(chǔ)上,將新疆本土鹽生植物的NHX基因?qū)敫仕{(lán)型油菜中,并對其轉(zhuǎn)化后植株的耐鹽性進(jìn)行了初步研究。1材料和方法1.1材料表面1.1.1facieseha105基因載體構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105轉(zhuǎn)化受體菌由本實驗室保存,植物表達(dá)載體pBI121由本實驗提供,鹽角草NHX基因克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建由本實驗完成。1.1.2植物材料1.1.3s100.mool/l基本培養(yǎng)基MS。預(yù)培培養(yǎng)基MS(A):MS+1.0mg/L2,4-D;共培培養(yǎng)基MS(B):MS+5.0mg/L6-BA+0.02mg/LNAA+5.0mg/LAgNO3(+AS200!mol/L);篩選培養(yǎng)基MS(C):共培養(yǎng)培養(yǎng)基+500mg/LCb+7.0mg/LKana;壯苗繼代培養(yǎng)基MS(D):共培養(yǎng)培養(yǎng)基+500mg/LCb+10mg/LKana;生根篩選培養(yǎng)基MS(D):MS(B)+0.5mg/LIBA+500mg/LCef+10mg/LKana,以上培養(yǎng)基均附含30g/L蔗糖,8g/L瓊脂pH5.8～6.0。搖菌培養(yǎng)基YEP:酵母浸粉10g/L,蛋白胨10g/L,NaCl5g/L(pH7.0);以上各培養(yǎng)基中所用的AgNO3,Cb,kan,Cef均采用過濾滅菌,其它則在121℃下進(jìn)行高溫高壓滅菌。1.2方法1.2.1柄葉的生物活性培養(yǎng)A.選取籽粒飽滿、大小均一的油菜種子,用70%的酒精浸泡30s,再用0.1%升汞處理7min,無菌水反復(fù)沖洗8～10遍,播種于1/2MS培養(yǎng)基上,置25℃、16h光照/8h黑暗的光照周期下培養(yǎng)5d,光強為1600～2000lux。B.切取5d苗齡的帶柄子葉,接種于含1.0mg/L2,4-D的MS0預(yù)培養(yǎng)基中,預(yù)培養(yǎng)3d。C.鑒定正確帶有外源目的的農(nóng)桿菌浸染前的二次活化濃度最好控制在OD600=0.6～0.8,6000rpm離心7min,無菌條件下MS液體培養(yǎng)基洗滌兩遍,每次都需用槍頭使菌體均勻懸起,用MS稀釋最終濃度至OD600=0.3～0.4。D.將預(yù)培養(yǎng)的帶柄子葉轉(zhuǎn)至一無菌的錐形瓶中,加入稀釋好的菌液,放入28℃搖床計時15min,在超凈工作臺取出浸染好的外植體用無菌濾紙吸干多余菌液并在超凈工作臺中充分吹干,再轉(zhuǎn)入共培培養(yǎng)基MB5A中。E.共培養(yǎng)48～72h,避光暗培。此過程可明顯的看到帶柄子葉的長大與伸長,而且以其基部褐化輕(肉眼觀察基部呈白色)為最佳。F.共培結(jié)束后,轉(zhuǎn)至初篩培養(yǎng)基中。設(shè)兩組對照:a.預(yù)培養(yǎng)前轉(zhuǎn)至初篩培養(yǎng)基中;b.預(yù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)至初篩培養(yǎng)基中。G.初篩后加大篩選力度并進(jìn)行生根培養(yǎng)。1.2.2目的基因整合活性及rt-pcr檢測A.PCR檢測取對照未轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因卡那抗性綠苗葉片,提取未浸染植物基因組DNA為對照組模板,以P1:TCAGGATCCATGTGGTCACAGTTAAGC和P2:AGTGTCGACTGTTCTCTGTGACAAATTAGTGG為引物,以浸染植物基因組為實驗組模板,PCR程序為:(1)95℃預(yù)變性2min;(2)95℃變性30s,58.5℃退火30s,72℃延伸2min,35個循環(huán)后;(3)于72℃延伸7min擴(kuò)增NHX目的基因1700bp片段來檢測目的基因的整合情況。B.RT-PCR檢測取對照未轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因卡那抗性綠苗葉片,提取植株總RNA,引物與上相同,PCR程序與上相同;RT-PCR程序為:42℃30min,99℃10min,5℃5min。1.2.3生長條件觀察當(dāng)油菜苗長至一周齡以后分別以50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM的NaCl溶液以未轉(zhuǎn)化NHX基因植株為對照對幼苗進(jìn)行鹽脅迫,兩周后恢復(fù)正常的培養(yǎng)條件觀察植株生長條件。2結(jié)果與分析2.1間對于農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的作用外植體為5日齡帶柄子葉,膿桿菌浸染條件600nmOD為0.3搖床搖15min,kana濃度為7mg。在農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中,菌液的活力及浸染時間對于農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化尤為重要。我們在實驗中發(fā)現(xiàn),當(dāng)菌液濃度為0.3浸染7min時,卡那抗生素綠苗的得率約為10%～12%。隨著菌液濃度的升高,OD600大于0.5時,在后期的篩選分化中抑菌困難,即使采用含高濃度羧芐的MS液體培養(yǎng)基進(jìn)行洗菌處理仍很難得到分化的綠苗。何業(yè)華等人在對甘藍(lán)型油菜進(jìn)行TA-29-Barnase基因轉(zhuǎn)化的研究中使用OD6000.5浸染5min時得到了較高的轉(zhuǎn)化率,這可能是所用受體材料的基因型不同造成的。2.2rt-pcr檢測nhx在不同的基因組中表達(dá)以NHX基因的特異性引物對篩選所得的卡那抗性綠苗進(jìn)行PCR擴(kuò)增,有6株得到了大小約1700bp的目標(biāo)片段(圖1),進(jìn)一步選取其中4株進(jìn)行了RT-PCR檢測,出現(xiàn)了特異的條帶(圖2),初步表明目的基因NHX已整合到油菜的基因組中。2.3鹽脅迫對植株生長的影響當(dāng)油菜苗長至一周齡以后分別以50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM的NaCl溶液以未轉(zhuǎn)化NHX基因植株為對照轉(zhuǎn)化了NHX基因植株為實驗組對幼苗進(jìn)行鹽脅迫,兩周后發(fā)現(xiàn)對照組油菜在200mM-NaCl以上濃度均發(fā)生葉片枯黃現(xiàn)象,而實驗組最高能夠耐受300mMNaCl濃度。并且在恢復(fù)正常的培養(yǎng)條件后對照組出現(xiàn)了嚴(yán)重的生長抑制現(xiàn)象,試驗組很快就恢復(fù)了正常的生長狀況,只有小部分植株無法恢復(fù)正常狀態(tài)。(圖3)3討論3.1通過實驗方法解決農(nóng)桿菌污染的障礙在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因工作中首先遇到的比較難解決的問題就是農(nóng)桿菌浸染植株后農(nóng)桿菌污染問題會比較嚴(yán)重,提高抗生素濃度會抑制轉(zhuǎn)基因植株的生長。因此在本實驗中對浸染后如何用簡單有效的方法來抑制農(nóng)桿菌的生長進(jìn)行了摸索。在不增加抗生素濃度的情況下,降低浸染菌液的濃度,延長浸染時間,并且要保持培養(yǎng)基的干燥,浸染完成后充分吸干外植體上殘留的菌液,然后在超凈工作臺中吹干。這樣就簡單有效的解決了農(nóng)桿菌污染問題。2,4-D對芽器官具有很強的誘導(dǎo)作用,本實驗中帶柄子葉通過短時間1mg/L2,4-D的預(yù)培養(yǎng),一方面極大的提高了外植體的再生頻率,同時據(jù)V.Cardoza。等研究,外植體在含有2,4-D的培養(yǎng)基中合成了一種含酚的化合物它可以激活農(nóng)桿菌的vir區(qū),利于外源基因的轉(zhuǎn)移和整合,從而可大大提高轉(zhuǎn)化效率。本文也是國內(nèi)外首次報道將帶柄子葉在1mg/L2,4-D中預(yù)培3d后使遺傳轉(zhuǎn)化效率大大提高。3.2帶柄葉鹽土壤改良劑鹽害抑制生長是植物的一種自我保護(hù)機制,有些植物在鹽害很嚴(yán)重時,細(xì)胞仍大量分裂和增殖,便會因能量供應(yīng)不足而枯萎死亡.篩選過程中發(fā)現(xiàn)潛在的突變體多是一些相對較小的植株,可能是植物的根首先接受高鹽信號,非抗鹽植株由于不能及時控制有害離子的吸收,導(dǎo)致體內(nèi)鹽濃度過高而受到損害;而潛在突變體能積極地響應(yīng)鹽脅迫,及時地阻止有害離子向上部運輸,從而使葉片免受離子的毒害,仍保持綠色.此外在篩選過程中還發(fā)現(xiàn)許多假陽性植株在高鹽基質(zhì)上真葉保持綠色,但是移至正?；|(zhì)時真葉卻變褐,而真正的抗鹽突變體卻始終保持綠色,可能是突變體能通過主動運輸而將鹽離子從根部排出,而假陽性植株僅僅是暫時將鹽離子積累在根部,并非真正的抗鹽,移至正?；|(zhì)后,根部高鹽信號消失,代謝過程恢復(fù)正常,積累在根部的有害離子隨著水分運輸?shù)饺~片,使葉片受害變褐。實驗分析結(jié)果表明:帶柄子