·1·NK細(xì)胞毒檢測·2·自然殺傷細(xì)胞（NK）介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，它不依賴抗體和補體，即能直接殺傷靶細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞或被病毒感染的細(xì)胞等；此外，尚有免疫調(diào)節(jié)功能，也參與移植排斥反應(yīng)和某些自身免疫病的發(fā)生發(fā)展。NK細(xì)胞活性可作為判斷機體抗腫瘤和抗病毒感染的指標(biāo)之一。例如在血液系統(tǒng)腫瘤、實體瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性減低；宿主抗移植物反應(yīng)者，NK活性升高。

NK細(xì)胞活性檢測·3·實驗分組及材料實驗原理檢測方法主要操作步驟結(jié)果判定主要內(nèi)容·4·器材75%酒精 若干5ml注射器1個/組100ml燒杯1個/組無菌紗網(wǎng) 1塊/組無菌平皿 1塊/組無菌吸頭（大、中、?。?盒/room無菌96孔培養(yǎng)板 1塊/組無菌離心筒1個/組可調(diào)微量加樣器 1套/組細(xì)胞計數(shù)板1套/組顯微鏡 1臺/組EP管 若干眼科剪、小鑷子 1套/組細(xì)胞培養(yǎng)箱1臺/room酶標(biāo)儀1臺離心機 2個/room超凈臺 1臺/組動物、細(xì)胞及試劑小鼠 1只/組(NS,OVA)YAC-11*106*2ml

培養(yǎng)液（DMEM)無FCS 10ml/組培養(yǎng)液(DMEM)10%FCS10ml/組LDH底物 3ml/組檸檬酸（終止液）1ml/組分組：每組4人1只小鼠實驗分組及材料·5·NK（naturalkiller）細(xì)胞屬非特異性免疫細(xì)胞，為機體的天然免疫系統(tǒng)中主要的效應(yīng)細(xì)胞，是與T、B細(xì)胞并列的第三類群淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞可非特異直接殺傷靶細(xì)胞，這種天然殺傷活性既不需要預(yù)先由抗原致敏，也不需要抗體參與，且無MHC限制。YAC-1細(xì)胞為Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤細(xì)胞，對NK細(xì)胞敏感，可用于檢測NK細(xì)胞的殺傷活性。原理通過殺傷激活受體（KAR）直接識別通過抗體間接識別：ADCC分泌殺傷介質(zhì)：perforingranzymeTNFIFN

清除異常細(xì)胞（腫瘤、病原體感染）

NK細(xì)胞功能：清除異常細(xì)胞通過殺傷激活受體（KAR）直接識別通過抗體間接識別：ADCC實驗原理

NK細(xì)胞+靶細(xì)胞靶細(xì)胞破裂,釋放內(nèi)容物胞漿內(nèi)酶類LDH酶活性胞漿內(nèi)蛋白放射性鉻酸鈉51Cr標(biāo)記DNA3H-TdR摻入·10·密度梯度離心Ficoll密度梯度離心Percoll密度梯度離心磁化細(xì)胞分離器分離法

NK細(xì)胞分離方法·11·同位素釋放法：51Cr、3H-TdR、125I-UdR

乳酸脫氫酶釋放法(本次實驗采用)

常用的檢測方法·12·G0G1SNa251CrO4、

3H-TdR、125I-UdR

NewDNAOrProteincpm同位素釋放法·13·應(yīng)用放射性同位素（如51Cr）標(biāo)記靶細(xì)胞，當(dāng)靶細(xì)胞受到NK細(xì)胞攻擊，靶細(xì)胞被破壞，釋放出51Cr。51Cr輻射γ射線，通過測定受損傷或死亡靶細(xì)胞釋放到上清中51Cr的放射脈沖數(shù)(cpm)，即可計算出NK細(xì)胞毒活性。同位素釋放法·14·乳酸脫氫酶(LDH)存在于細(xì)胞內(nèi)，正常情況下，不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時，LDH可從細(xì)胞內(nèi)釋放至培養(yǎng)液中。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶I(NAD+)變成還原型輔酶(NADH)，后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(lán)(INT)或硝基氯化四氮唑藍(lán)(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波長處有一吸收峰，利用讀取的Ａ值，可測得殺傷細(xì)胞毒活性。乳酸脫氫酶釋放法-原理·15·靶細(xì)胞YAC-1NK殺傷LDH釋放到細(xì)胞外無色底物L(fēng)DH底物還原有色物質(zhì)測OD570值乳酸脫氫酶釋放法靶細(xì)胞膜損傷最大釋放均值（Max）=最大釋放孔cpm均值-最大釋放對照孔cpm均值自發(fā)釋放均值（S自發(fā)）=自發(fā)釋放孔cpm均值-培養(yǎng)基對照孔cpm均值

殺傷率(%)=Max-S自發(fā)實驗值-自發(fā)釋放值×100·16·操作流程1W無菌取脾研磨成單細(xì)胞懸液+2ml1640（無FBS)細(xì)胞計數(shù)【?/ml】取20ul細(xì)胞+980ul的1640混勻后取出20ul細(xì)胞+20ul臺盼藍(lán)加板(三復(fù)孔)(加法見附圖)調(diào)細(xì)胞濃度1×107/ml5%CO237℃培養(yǎng)2小時離心，取100ul上清移入新孔，37℃孵育10min加入底物100ul/well室溫避光孵育15min

30

l/孔1mol/L檸檬酸

酶標(biāo)儀測吸光度值：OD570nm結(jié)果判定：培養(yǎng)YAC－1細(xì)胞＋10%FBS

1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度1×106/ml·17·單細(xì)胞懸液的制備小鼠脫臼處死，75%酒精浸泡消毒2-3分鐘。于超凈臺內(nèi)取出脾組織，放入預(yù)先盛有5ml1640培養(yǎng)液的平皿內(nèi)。用紗網(wǎng)包裹住脾組織，將脾剪成小塊，用5ml注射器塞輕壓使脾細(xì)胞透過紗網(wǎng)。然后用1000ul加樣器隔著紗網(wǎng)將細(xì)胞懸液吸出，放入50ml離心管中，再分別用1ml培養(yǎng)液沖洗紗網(wǎng)和平皿，并將細(xì)胞懸液吸出，放入同一50ml離心管中，剩余3ml培養(yǎng)液備用。1000rpm，常溫離心10分鐘，棄上清，加1ml1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)：取上述制備好的細(xì)胞懸液混勻后取出20ul，加到盛有980ul計數(shù)液的EP管中，混勻后取出20ul到一個新的EP管中，再向其中加入20ul臺盼藍(lán)染料，混勻后取20ul計入到細(xì)胞計數(shù)版上，在顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)方法見后。調(diào)脾細(xì)胞濃度至1×108/ml，每組所需總量為1ml調(diào)YAC－1細(xì)胞濃度至1×106/ml，每組需2ml注意:在稀釋前一定將原細(xì)胞懸液混勻，否則細(xì)胞長時間沉淀使細(xì)胞數(shù)不準(zhǔn)。實驗步驟·18·細(xì)胞培養(yǎng)：按圖所示加板。將板做好標(biāo)記，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，然后放于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2小時。LDH底物：在培養(yǎng)2小后，1000rpm，離心5min，取100ul上清液移入新孔內(nèi)，于每孔內(nèi)加入LDH底物100ul，加完后輕輕搕板，使之混勻。室溫避光保存15min。

取出，加入1mol/L檸檬酸，30

l/孔。酶標(biāo)儀讀數(shù)前保證沒有氣泡。結(jié)果測定：結(jié)果測量：用酶標(biāo)儀測定光密度值：OD570nm。記錄結(jié)果。結(jié)果判定：Max（靶細(xì)胞最大釋放）=最大釋放孔均值-最大釋放對照孔均值S自發(fā)

（靶細(xì)胞自發(fā)釋放）=自發(fā)釋放孔均值-培養(yǎng)基對照孔均值注：S自發(fā)＜0，做“0”處理實驗步驟SI=Max-S自發(fā)實驗孔值-自然釋放孔值×100%·19·1-34-67-910-12A自然釋放孔100ulYAC-1cells+100ul10%1640B(E:T=100:1）

100ulYAC-1cells+100ulspleenCellsC(E:T=50:1）100ulYAC-1cells+50ulspleenCells

+50ul10%1640D(E:T=25:1）100ulYAC-1cells+25ulspleenCells

+75ul10%1640E最大釋放孔10ulYAC-1cells+90ul10%1640+100ul1%triton100F最大釋放對照孔100ul1%triton100

+100ul10%1640G培養(yǎng)基對照孔200ul10%1640Max=E-F

S自發(fā)=A-G

加板方法Max-S自