原發(fā)性開角型青光眼MYOC基因

C1009缺失突變致病機理的研究謝小兵湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院湖南郴州2012年8月內容綱要一、青光眼概述二、原發(fā)性開角型青光眼突變

基因篩查三、青光眼致病機理研究--基因功能研究（細胞/動物水平）一、青光眼概述疾病基本特征：病理性高眼壓、視神經(jīng)萎縮、視盤凹陷擴大及進行性視野缺損（視力減退）。病因：尚不清楚，一般認為是由多種因素引起?，F(xiàn)認為主要是由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致。發(fā)病情況：是世界上第二大致盲性眼病，僅次于白內障。其分類有多種，其中近一半為原發(fā)性開角型青光眼（primaryopenangleglaucoma，POAG）。2010年全世界有6000多萬人患有POAG，其中有450萬人會失明。原發(fā)性繼發(fā)性開角型閉角型病因學前房角發(fā)病年齡嬰幼兒型青少年型成人型①②③前房的位置房水循環(huán)示意圖開角型青光眼示意圖閉角型青光眼示意圖前房形態(tài)瞳孔睫狀肌后房前房前房角小梁網(wǎng)（Schlemm）集液管房水靜脈施萊姆氏管正常房水循環(huán)途徑青光眼的遺傳傾向：大量的家系調查發(fā)現(xiàn)，約13%～47%的開角型青光眼具有家族史，開角型青光眼發(fā)病率為2.8%～16.4%，遠高于正常群體的發(fā)病率。青光眼的相關致病基因：目前至少發(fā)現(xiàn)7條染色體與POAG相關。MYOC基因是最先確定的與POAG相關的致病基因。1號染色體：MYOC基因：圖11號染色體結構及MYOC基因結構圖1q24～25

已報道的與POAG有關的致病性MYOC基因突變二、突變基因的篩查（一）大型原發(fā)性開角型青光眼家系調查：

1.該家系共56人，其中男性27人，發(fā)病7人，女性29人，發(fā)病4人。2.MYOC基因突變篩查：RFLP、SSCP法篩查3.突變蛋白二級結構分析及統(tǒng)計學分析

研究發(fā)現(xiàn)在不同地區(qū)不同種族POAG的MYOC基因突變現(xiàn)象并不相同，MYOC90%的基因突變位于第3個外顯子。目前較肯定的與青光眼發(fā)病有關的突變有:Tyr437His（human)、Tyr423His(mouse)、Pro370Leu、Glu337Arg、Gly357Val等。1.TransgenicMiceExpressingtheTyr437HisMutantofHumanMyocilinProteinDevelopGlaucomaInvestOphthalmolVisSci.2008May;49(5):1932–1939.2.ExpressionofMutatedMouseMyocilinInducesOpen-AngleGlaucomainTransgenicMiceTheJournalofNeuroscience.November15,2006,26(46):11903–11914

實驗分組：1.青光眼家系組(56人）2.正常對照組（200例）

入選標準：

⑴體檢健康者；⑵年齡20~60歲；⑶無青光眼家族史；⑷眼底及眼壓檢查正常者。突變篩查：2％瓊脂糖凝膠電泳檢測產物條帶①DNA的提?。和庵苎酶牧糔aI法提取模板DNA②PCR擴增：引物設計：MYOC第一外顯子：6對引物；PCR產物分別命名為MYOC1～6；

MYOC第二外顯子：1對引物；PCR產物命名為MYOC7；MYOC第三外顯子：6對引物；PCR產物分別命名為MYOC8～13。③產物鑒定：④PCR產物酶切及突變分析：PCR-RFLP法共篩查了分布于MYOC基因三個外顯子的13個點突變，酶切產物經(jīng)8％PAGE鑒定。氨基酸改變堿基改變PCR區(qū)段限制性內切酶酶切片段（bp）結果Pro13LeuC38TMYOC1AsuI未突變突變155,191745例可疑Arg46TermC136TMYOC2BsuRⅠ未突變突變118,78196無異常Gln48HisG144TMYOC2BseNⅠ(BsrⅠ)未突變突變69,127196無異常Arg76LysG227AMYOC3Alw261(BsmAⅠ)未突變突變93,961893例可疑Asp208GluC624GMYOC7Alw261(BsmAⅠ)未突變突變57,17757,77,100無異常Gly246ArgG736AMYOC8BseLⅠ(BsiYⅠ)未突變突變48,129177無異常ln337stopC1009delMYOC10Bme1390Ⅰ未突變突變56,61,7356,13412例可疑Ile345MetA1036GMYOC10PagⅠ(BspHⅠ)未突變突變19084,106無異常Pro361SerC1081TMYOC10Bme1390Ⅰ未突變突變56,61,736,129無異常Gly367ArgG1099AMYOC10BseDⅠ(SecⅠ)未突變突變8,15,42,53，728,53,57,72無異常Asp380AsnG1138AMYOC11Tru1Ⅰ未突變突變19749,148無異常Ile477SerT1430GMYOC13NmuCⅠ(Tsp45Ⅰ)未突變突變73,10653,53,73無異常Pro481LeuC1442TMYOC13MnlⅠ未突變突變25,15425,74,80無異常所篩查的突變位點及酶切結果

具體酶切結果如下：

1.MYOC1片段全長174bp，檢測出了一個位于第一外顯子的新的點突變38C→T。未突變片段存在限制性內切酶AsuI的酶切位點，突變后則該酶切位點消失。經(jīng)該酶消化完全后，可見明顯的雜合子條帶。該突變存在于家系的4例已確診病人和1例可疑者中，在對照組中未檢出。MYOC1片段AsuI酶切結果圖1：家系病人（（C,T）雜合子）2：正常對照組3：PCR產物M：DNAmarker2.MYOC3片段全長189bp，未發(fā)生突變時有一個Alw261酶切位點，酶切后片段為93bp和96bp，若發(fā)生突變則酶切位點消失。經(jīng)酶切，發(fā)現(xiàn)酶切后片段為93bp、96bp和189bp者3例，為雜合子，由于93bp和96bp兩條片段只相差3bp，在8%的PAGE上分辨率比較低，只能觀察到重疊影。證實發(fā)生了G227T突變。MYOC3片段Alw261酶切結果圖1：雜合子2：純合子3：PCR產物M：DNAMarker3.MYOC10片段全長190bp，未發(fā)生突變時有2個Bme1390Ⅰ酶切位點，酶切后片段為56bp、61bp和73bp，若發(fā)生1009位點突變，則酶切后片段為56bp和134bp。經(jīng)酶切，發(fā)現(xiàn)酶切后片段為56bp和134bp者2例，片段為56bp、61bp、73bp和134bp者10例，存在1009位點C堿基缺失突變。MYOC10片段酶切結果圖1：雜合子2：未突變產物3：純合子4：PCR產物M：DNAMarker⑤陽性PCR產物測序結果

將根據(jù)酶切篩選出的異常結果進行雙向測序，測序表明在38位點C變?yōu)門，227位點G突變?yōu)锳，在1009位點發(fā)生C堿基缺失。

C38T（Pro13Leu）測序圖（箭頭所指為雜合子雙峰）G227A(Arg76Lys)測序圖C1009del(Gln377stop)測序圖PCR產物測序結果⑥統(tǒng)計學分析在該56人的家系中，227G→A、C1009del和38C→T三種突變篩選情況如下表：

家系中三種突變的篩選情況突變確診(例）表型正常（例）合計（例）正常對照組（例）227G→A2130C1009del11112038C→T4150結論1.本研究在POAG家系中，共發(fā)現(xiàn)MYOC基因三個突變,分別是G227A、C1009del和C38T,其中后兩個突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)。2.G227A突變者3例，其中2例為已確診的POAG病人,1例為家系中表型正常人，對照組中未發(fā)現(xiàn)3.C1009del突變者12例，其中11例已經(jīng)確診POAG,在1例4歲的子代親屬中也發(fā)現(xiàn)該突變。正常對照組中未發(fā)現(xiàn)4.C38T突變存在于4例已確診的POAG病人和1例可疑者中，正常對照組中未檢出。這三個突變的發(fā)病率在家系組和正常對照有統(tǒng)計學意義。C1009delFJ237047（二）蛋白結構的生物信息學分析

進行蛋白質結構分析

（蛋白質分析軟件Antheprot4.3）

蛋白質一級結構分析：1.第227位點的堿基改變G→A導致第76位氨基酸由精氨酸變?yōu)橘嚢彼幔ˋrg76Lys）。G227A（Arg76Lys）突變前后氨基酸序列對比

2.第1009位點的C堿基缺失(C1009del)導致終止密碼子提前出現(xiàn)C1009del突變前后氨基酸序列對比C38T突變前后氨基酸序列對比3.對38位C堿基突變?yōu)門堿基，導致第13位氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼?。G227A（Arg76Lys）突變前后蛋白質二級結構預測（DMP法）蛋白質二級結構預測分析

1.G227A（Arg76Lys）突變前后，蛋白質結構未發(fā)生明顯變化C1009del突變前后蛋白質二級結構預測（DMP法）2.C1009del突變前后蛋白質二級結構發(fā)生了較大變化C38T突變前后蛋白質二級結構預測對比（DMP法）3.C38T突變前后：

導致蛋白質的氨基酸序列發(fā)生了改變（脯氨酸→亮氨酸），但并未造成蛋白質的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲等二級結構的明顯改變。G227A（Arg76Lys）突變前后蛋白質理化特性曲線

蛋白質理化特性分析分析結果：突變前后蛋白質的抗原性、親水性、疏水性、溶解性等理化性質都未發(fā)生明顯改變C1009del突變前后蛋白質理化特性曲線分析結果：蛋白質的抗原性、親水性、疏水性、溶解性等理化性質都發(fā)生了較大變化。C38T突變前后蛋白質理化特性曲線對比分析結果：蛋白質的抗原性、親水性、疏水性、溶解性等理化性質未發(fā)生明顯改變。結論1.蛋白質的一級結構分析結果顯示G227A突變→Arg76Lys；C1009del導致氨基酸發(fā)生移碼突變；

C38T突變→Pro13Leu2.蛋白質二級結構分析結果顯示G227A突變前后和C38T突變前后，蛋白質的結構和性質未發(fā)生明顯改變，而C1009del突變前后，蛋白的物理性質發(fā)生了明顯變化，這些性質變化可能影響了蛋白之間的相互反應，可能與青光眼的發(fā)生相關。MYOC基因突變致病機理？青光眼發(fā)生的分子機制？青光眼房水循環(huán)三、轉基因細胞水平功能研究（一）RNA干擾技術對MYOC基因

C1009del突變小梁細胞模型的構建流程1、目的基因RNA干擾慢病毒載體制備

針對目的基因靶序列，利用公用網(wǎng)站按照RNA干擾序列設計原則，設計多個RNA干擾靶點序列，選擇最佳靶點；陽性克隆質粒抽提：

瓊脂糖凝膠電泳圖：1號泳道：marker；10kb，9kb，8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1Kb，900bp，750bp，600bp，500bp2、3、4、5號泳道分別代表psc-1、psc-2、psc-3、psc-4質粒載體；6號泳道代表pscNC（普適性陰參對照）質粒載體。2、目的基因過表達載體構建

1#：陰性對照（ddH2O）2#：陰性對照（空載組）3#：陽性對照（有確定插入片段的載體組）4#：Marker：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。5#-10#為pEGFP-N1-MYOC

PCR鑒定陽性克隆

使用293T細胞檢測融合基因是否表達

因真核表達載體pGFP－N1上含有綠色熒光蛋白GFP的基因，當重組融合基因成功轉染進入293T細胞后，如果融合基因能夠表達，則綠色熒光蛋白也被翻譯，從而細胞在熒光顯微鏡下可顯示綠色熒光，故可通過觀察綠色熒光的有無來判斷融合基因是否表達。熒光鏡檢與白光鏡下結果：293T細胞熒光鏡檢結果293T細胞白光鏡檢結果陽性克隆測序

3、WesternBlot篩選RNAi有效靶點

構建好含有目的基因的過表達克隆質粒和針對靶基因不同干擾靶點的RNAi病毒載體質粒，共轉染培養(yǎng)好的工具細胞（即293T細胞），轉染24h熒光顯微鏡下觀測轉染效果，轉染36～48h收集細胞抽提蛋白，采用Westernblot檢測目的蛋白的表達情況，進而判斷不同靶點的干擾效果。WesternBlot結果掃描（第一次實驗的knockdown檢測）WesternBlot結果掃描（第二次實驗的knockdown檢測）注釋：PC：加入pcDNA3.1質粒；NC1：對照組1，不含干擾靶點的敲減質粒；NC2：對照組2，含有紊亂序列的敲減質粒；1＃，2＃，3＃，4＃：含有不同干擾靶點的敲減質粒；0.5μg，1.0μg：加入的質粒量（1）293T細胞共轉染實驗（2）WesternBlot檢測目的基因表達水平結論

本實驗通過設計并構建4個針對目的基因的4個干擾質粒，通過兩次篩靶實驗的結果可以看到，1#，2#和3#對MYOC有敲減作用，在兩個質粒濃度下的作用基本是一致的。此外，4#也有一些作用，特別是在高濃度下，隨機選擇3#干擾靶點(PSC413)進行慢病毒大量包裝。4、檢測小梁細胞MYOC基因KnockDown效率

細胞總RNA抽提：RNA逆轉錄獲得cDNAReal-timePCR檢測定量PCR擴增曲線第一次

定量PCR擴增曲線-第二次

結果統(tǒng)計圖-第一次

結果統(tǒng)計圖-第二次

注：CON:未感染任何病毒的小梁細胞；KL376:感染過表達MYOC慢病毒的細胞；KL376+NC:陰性對照；KL376+KD:感染針對MYOC的RNAi慢病毒的細胞。統(tǒng)計學分析Westernblot

檢測KD效率

準備靶細胞慢病毒感染靶細胞提取感染靶細胞的總蛋白Westernblot

從圖可見在<90KD處出現(xiàn)陽性條帶。認為該條帶就是目的蛋白的條帶。該圖顯示：靶點感染組（標注為413）相對陰性對照組（標注為NC），陽性條帶更弱，表明靶點組目的蛋白表達水平下調。因此psc413是有效的RNAi靶點。（CON：未感染過表達MYOC病毒的小梁細胞）無條帶，細胞本底基本不表達MYOC基因，成功構建了小梁細胞模型。（二）MYOC基因C1009del的定點突變

定點突變技術是蛋白質工程中采用的重要技術之一，它是在已知基因的預定位點通過替換、插入或缺失一定長度的核苷酸片段，精確地改變基因的特定堿基序列，從而研究基因表達調控機制及蛋白質結構與功能的關系，從微觀水平上闡述正常狀態(tài)下基因調控機理及與疾病的關系。

1、構建青光眼相關基因MYOC的C1009del突變（1）感受態(tài)細胞的制備（2）MYOC基因C1009del突變質粒載體的構建對陽性菌落的基因用引物EGFP-N-R進行測序分析，其測序結果如下：

測序結果顯示成功完成了MYOC基因C1009del的定點突變（3）陽性重組體轉化入感受態(tài)細胞2、小梁細胞的培養(yǎng)小梁細胞：來源于本實驗室液氮中的保種細胞。用G418進行細胞篩選G418一種氨基糖苷類抗生素。在分子遺傳實驗中,是穩(wěn)定轉染最常用的抗性篩選試劑。當neo基因被整合進真核細胞DNA后,則能啟動neo基因編碼的序列轉錄為mRNA，從而獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達，使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。

G418的這一選擇特性，已在基因轉移、基因敲除、抗性篩選以及轉基因動物等方面得以廣泛應用。正常生長的小梁細胞（未用G418篩選前）

陰性對照細胞（未導入突變基因）

含300μl/mlG418的培養(yǎng)基中的細胞形態(tài)含400μl/mlG418的培養(yǎng)基中的細胞形態(tài)含500μl/mlG418的培養(yǎng)基中的細胞形態(tài)含700μl/mlG418的培養(yǎng)基中的細胞形態(tài)小梁細胞：來源于本實驗室液氮中的保種細胞。利用不同濃度的G418篩選10天后的單個視野中小梁細胞

在第14天時觀察細胞長勢，發(fā)現(xiàn)G418終濃度：

≥400μl/ml，小梁細胞全部凋亡，看不到貼壁細胞；=300μl/ml，尚有貼壁存活的小梁細胞。因此，決定400μl/ml的G418濃度作為后續(xù)篩選導入突變基因的小梁細胞的濃度。四、動物水平基因功能研究（一）轉基因小鼠模型的構建（1）構建MYOC基因C1009缺失突變過表達載體（2）DNA顯微注射

DNA顯微注射1.促排和取卵：人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導母鼠排卵，和雄鼠合籠，用頸椎脫臼法處死有陰道栓的雌鼠，在解剖鏡下找出輸卵管傘部，解剖出受精卵。2.不育雄性公鼠：結扎公鼠假孕雌性母鼠：在正式實驗前，結扎公鼠需與性成熟的雌性小鼠交配，該雌性小鼠為假孕雌性母鼠。3.受精卵注射外源DNA：顯微操作儀、顯微持卵針和顯微注射針。4.注射后的受精卵移植至受孕后0.5天的假孕母鼠的輸卵管內（二）驗證轉基因小鼠是否為原發(fā)性開角型青光眼模型（1）測定IOP（2）小梁網(wǎng)細胞及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的退行性改變（三）功能研究3.定期測定IOP，分析IOP改變情況4.分析眼