第12章遺傳工程

本章教學(xué)時(shí)數(shù)：2學(xué)時(shí)。本章重點(diǎn)：基因工程的基本流程。本章難點(diǎn)：分子標(biāo)記和基因圖譜；研究基因功能的方法§1

遺傳工程概述

遺傳工程：細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程基因工程遺傳工程的概念遺傳工程（geneticengineering），也稱生物工程（biologicalengineering）。是指利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或更適合人類需求的產(chǎn)品的遺傳學(xué)手段。廣義遺傳工程和狹義遺傳工程：廣義：包括細(xì)胞工程、基因工程、酶工程和發(fā)酵工程等。狹義：基因工程。細(xì)胞工程在離體（invitro）條件下以細(xì)胞為基本單位，借助人工培養(yǎng)基，對生物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖，或者使其發(fā)生變異，從而改良生物品種、創(chuàng)造新品種、加速繁育，或利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的過程。細(xì)胞工程包括細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、生物體的克隆與規(guī)?；敝车取５谝粋€(gè)哺乳動(dòng)物的克隆——Dolly羊酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品。是酶學(xué)理論與化工技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)體系。發(fā)酵工程利用微生物與現(xiàn)代化工程技術(shù)相結(jié)合，工廠化生產(chǎn)人類需要的物質(zhì)的一種技術(shù)體系。目前醫(yī)用抗生素、農(nóng)用抗生素絕大部分都是發(fā)酵工程產(chǎn)品?；蚬こ汤萌斯し椒ㄔ隗w外（invitro）切割、拼接、重組生物的遺傳物質(zhì)，獲得重組DNA分子，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞或個(gè)體，使受體的遺傳特性得到修飾或改良?；蚬こ滩僮鞯膶ο笫荄NA分子。又稱為重組DNA技術(shù)重組DNA技術(shù)流程§２基因工程的工具酶內(nèi)切核酸酶(endonuclease)DNA連接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）限制性內(nèi)切核酸酶或稱限制性酶(restrictionenzyme),是基因工程最重要的工具。在細(xì)菌中這些酶的功能是降解外來DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。這類酶能識別雙鏈DNA分子中特異的核苷酸序列，并在特定的位置將雙連DNA分子切斷。EcoRⅠ限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則：根據(jù)分離出這種酶的細(xì)菌在分類學(xué)上的屬名、種名和菌株名來命名。名稱的第一個(gè)字母是該細(xì)菌的屬名的第一個(gè)字母，大寫，斜體。名稱的第二、三個(gè)字母是該細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母，小寫，斜體。名稱的第四個(gè)字母是菌株的名稱，大寫或小寫，正體。如果沒有菌株名稱就不寫。名稱最后的是羅馬數(shù)字，表示從這種細(xì)菌中分離出來的酶的序號，如從某個(gè)菌株中分離出來的第一種酶為Ⅰ，第二種酶為Ⅱ，等等。如EcoRⅠ來自大腸桿菌（Escherichiacoli）R菌株，讀作echo-r-one；HindⅢ來自流感噬血桿菌（Hemophilus

influenzae）d菌株,讀作hind-three限制酶的分類限制性核酸內(nèi)切酶的工作分為2個(gè)步驟：識別特定的DNA序列在特定的位置切割DNA分子根據(jù)其作用特點(diǎn),可以將限制性酶分為三種類型：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型。在基因工程中用途最廣泛的是Ⅱ型限制酶。Ⅰ型限制酶有特定的識別序列但切割位置遠(yuǎn)離識別位置有的種類可以在同識別序列相距1000bp的位置上隨機(jī)切割DNA分子在基因工程中沒有什么用途Ⅲ型限制酶有特定的識別序列切割位置在識別序列3’端相距20bp處，可以產(chǎn)生各種類型的單鏈末端。Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途，但總體來說，用途不大。Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的識別序列而且其切割位點(diǎn)就在識別序列內(nèi)部基因工程中用途最廣識別序列是對稱的，在一條鏈中從5’到3’方向的序列與其互補(bǔ)鏈從5’到3’方向的序列完全相同，稱為回紋對稱序列(palindrome)。酶切與連接常見內(nèi)切酶DNA連接酶(DNAligase)共價(jià)連接5′－磷酸和3′－OH，形成磷酸二酯鍵(3′－

5′phosphodiesterbond)

，封閉DNA雙鏈上的缺刻(nick)。反轉(zhuǎn)錄酶

reversetranscriptase

§3載體(vector)將外源DNA片段運(yùn)送進(jìn)宿主細(xì)胞(hostcell)進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的運(yùn)載工具稱為載體。載體也是DNA分子。常用載體：細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。

都要經(jīng)過人工改造。細(xì)菌人工染色體（BAC）酵母菌人工染色體（YAC）人類人工染色體（HAC）載體的基本條件①有獨(dú)立的復(fù)制原點(diǎn)(ori)，能獨(dú)立地自我復(fù)制，而且能帶動(dòng)外源DNA一起復(fù)制。②具有多種限制性酶的切點(diǎn)，用于連接外源DNA片段。③載體上的限制酶酶切位點(diǎn)對于任何一種限制酶來說只能有一個(gè)。④具有一個(gè)選擇標(biāo)記基因。質(zhì)粒載體

①分子量小(2.69kb),但能攜帶較大的外源片段；②拷貝數(shù)多,在每個(gè)宿主細(xì)胞可達(dá)500個(gè)；③酶切位點(diǎn)多，克隆方便；④具有α-互補(bǔ)顯色表型,便于檢測。

互補(bǔ)顯色反應(yīng)

λ噬菌體（30kb）

粘粒（cosmid）載體（45kb）細(xì)菌人工染色體BAC（300kb）

bacterialartificialchromosome來源于F因子YAC（1Mb）

yeastartificialchromosomeTi質(zhì)粒Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌的染色體外遺傳物質(zhì)雙鏈閉合環(huán)狀DNA，150～200kb植物基因工程常用的載體Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)T-DNATransferDNA是農(nóng)桿菌侵入植物細(xì)胞時(shí)從Ti質(zhì)粒上轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNAT-DNA兩端個(gè)有一段25bp的同向重復(fù)序列，是T-DNA的邊緣區(qū)LB；RB在同一條單鏈的LB和RB內(nèi)各形成一個(gè)缺口，單鏈T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞§4

基因的分離與鑒定

從基因庫中分離基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因人工合成基因T－DNA標(biāo)簽法

(一)從基因庫中分離基因

1．構(gòu)建基因庫

2．篩選基因庫

3．陽性克隆的分析與鑒定

1．構(gòu)建基因庫

基因庫(library)是一組DNA或cDNA序列克隆的集合體。創(chuàng)建基因文庫的目的是從特定的材料中分離目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一個(gè)庫中，采用一定的方法在庫中篩選目的基因。同時(shí)也便于基因的長期保存?；蚪M文庫GenomicDNAlibrary使用與切割載體相同的限制酶，將供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段連接到載體上，構(gòu)成一個(gè)重組DNA群體這個(gè)群體包含全基因組的遺傳信息cDNA文庫

cDNAlibrary以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA(complementary

DNA，cDNA)將雙鏈cDNA與適當(dāng)載體連接轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，建成cDNA文庫基因組文庫與

cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有基因

cDNA文庫只包括某一特定細(xì)胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時(shí)期的表達(dá)序列分離特定基因，cDNA庫比較方便研究調(diào)控序列，必須基因組文庫從基因庫中篩選特定的克隆

一個(gè)基因文庫中有幾萬個(gè)克隆，目的基因到底在哪個(gè)克隆上呢？根據(jù)待選基因相關(guān)信息確定篩選方法和條件。最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探針，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，篩選基因庫DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補(bǔ)的核酸序列

DNA、cDNA、寡聚核苷酸單鏈、雙鏈同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、顏色標(biāo)記篩選文庫質(zhì)?；驇旌Y選細(xì)菌混合液在培養(yǎng)在平板上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上裂解細(xì)菌變性DNA標(biāo)記探針雜交漂洗放射自顯影或熒光檢測挑取對應(yīng)菌落、培養(yǎng)抽提質(zhì)粒陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進(jìn)一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因測序自動(dòng)測序儀功能分析預(yù)測軟件核酸序列測定的原理磷酸二脂鍵測序電泳圖譜核酸序列分析與功能預(yù)測同源性比較

同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因?？蓮暮怂峒暗鞍踪|(zhì)兩種水平比較基因間的同源性。將測出的核酸序列同雜交的探針序列進(jìn)行比較將得到的序列發(fā)到BLAST等DNAData庫的網(wǎng)址上比較開放閱讀框（openreadingframe,ORF）分析開放閱讀框：一段能編碼一條多肽鏈，并具有翻譯起始信號（ATG）和終止信號(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。來自cDNA庫的序列可直接進(jìn)行0RF分析，比較其與其他序列的同源性來確定其身份。來自核基因庫的序列，因大多數(shù)真核生物基因含有內(nèi)含子。開放閱讀框（openreadingframe,ORF）分析

TGCTCGCTCCTACGAATCCTGCCCCTGAGTAACAATGACTGACTTTTAATTTGTTTGCAG61CTAGGGTGGGGATCGAGATGGTGATCTTGGAGCAGCCACAGCTGCTCCTTCTTCTTCTTC121TTCTTGTAGCAGCTGCAGCTGCAACCGGCGCCACAGCAGCCGACGACGAGTTGGAGTGTC181CCTCCTCCATCTTCGGTAAGTAGCAAAGCACAGTATGACATTCACGAATGCATGTCATGA241TCTATCACTCCCTTTGTCTTCGCTACATTACATACTCTGCCTGTGTTTACCTACTGTACC301CGTCTTCAATTCAATTTGCTGTTGGCTCCCGCGCTTTCCCGAAGCCGCGTGTAGTAGTAT361CATAAAAGTAGGAGTAGATCTTTAATTTGCCCGGCGAAAACTGCTCCTAGTGGTAGATCT421TTGGCTCGGATCGGAGAAGATATTGTAGCTGTACTCTGATCGAGAGCATGCATGCTTGTT481AATCCGATCGAGCGTATTCCTCTGAGTTTGTTATGCTCTGATATTGTAATTGTGGCTGGA541TAATTTTCAAGAAAAAAAAATCGGTTACATACATGCATTTGCACTAATTAACTAGATTGT601GCATCAACAGATCACGCTGTGAACTCTCAAGGCGCCATTCAGTTCCCCGTGTTCCACAAG661AAGCACCAATGCCTCCGCCCATGGTCTGTCCGTGCAACCCAGGCATCCTCGACCGGAGCA721TCAGGAGCAGGAAAAGGAGGAGGATTGAACAATCTACAGGAAGAGGAGATCACTTCATCA781AGTAGTACAAAAATCGACGTGATCGAAGACAGCAGCATCAACGACTTCCTGTTCCTAATG841GCCGTCAGTCTGGGCAAGCCACCGGTTGTGAACCTGGTGGCGATCGACACGGGATCCACC901CTCTCGTGGGTGCAATGCCAGCCGTGCGCGGTGCACTGCCACACGCAGTCCGCGAAGGCC961GGCCCGATATTCGATCCCGGCAGATCCTACACATCCCGGCGAGTTCGCTGCTCGTCGGTC1021AAGTGCGGCGAGCTGAGGTACGATCTGCGGCTCCAGCAAGCCAATTGCATGGAGAAGGAA1081GACAGCTGCACGTACAGCGTCACGTACGGGAACGGGTGGGCGTACAGCGTGGGCAAGATG1141GTGACAGACACGCTGAGGATTGGGGACTCGTTTATGGATCTCATGTTCGGGTGCAGCATG1201GATGTCAAGTACAGCGAATTCGAGGCCGGCATCTTTGGTTTCGGCAGCAGCAGCTTCTCT1261TTCTTCGAGCAGCTGGCAGGGTACCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCATTAAGCTACTGC1321TTGCCCACTGACGAGACCAAGCCCGGATACATGATCCTGGGAAGATACGACCGTGCCGCC1381ATGGATGGGGGTTACACTCCTCTCTTCCGGTCAATCAACAGGCCAACCTACTCACTGACG1441ATGGAGATGCTTATCGCCAACGGGCAGAGATTGGTGACATCGTCTTCGGAGATGATCGTC1501GATTCCGGGGCCCAGAGGACGTCCCTGTGGCCTTCCACTTTTGCTCTCCTTGACAAGACC1561ATCACGCAGGCAATGTCGTCGATTGGGTATCACCGGACATCAAGAGCGCGCCAAGAATCA1621TACATCTGCTACTTATCGGAGCACGACTATTCTGGTTGGAACGGCACCATCACGCCCTTC1681TCCAACTGGTCCGCCTTGCCTCTGCTGGAGATCGGCTTCGCCGGCGGTGCTGCACTCGCT1741TTGCCACCCAGAAACGTCTTCTACAACGATCCACACCGCGGTTTGTGCATGACCTTTGCT1801CAGAATCCTGCTCTCAGGTCTCAGATACTGGGGAACAGGGTTACTCGATCCTTCGGAACA1861ACCTTCGACATCCAGGGGAAACAATTCGGCTTCAAATATGCCGTTTGCTGATCGTCGATT1921ATTCCTCATCCTATGATATCTTATAGCTTGCGGGTACGTACCAAGTATATATCAAACTAA1981TTGCATACATGCTCTCCCTCCCTCTGTCCATGCATGTCCTCGTTTCATTGCAAATCTGCA2041TCGATCAATCCAGTTACTGATAATTCCTCCTTATTAACTTAGGCTGATCGATCCATTGCT2101TCTCGTGTGTATATTATGCAGGTCGATTAATTAGCTGGTTTGCCCAAATAACTGATCGGA2161TTGGAGTCTTCTCCCGCGCTACACTACCCCTAGCTGCGATCGTATCACAAGCTAGCGGTA2221CTTGATTTGGGACCTAATTCGTTCAAAAAAAACTTGGCAGCTTAATTTGGGACCTAGTAG2281CTAGCTGAGCCACTACTAGATGTTTACGTACCAGCTATCCGTCGTTTGTTTGTGTCTCCT2341GTGCTTGTGCT2351bp(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因

利用PCR方法可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)使目的DNA片段擴(kuò)增到數(shù)百萬個(gè)拷貝。基本原理：根據(jù)待擴(kuò)增基因的部分序列合成成對引物，在體外合成兩個(gè)引物之間的DNA序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(PCR，polymerasechainreaction)PCR反應(yīng)根據(jù)待擴(kuò)增基因序列合成兩個(gè)引物，10-20bp,分別與待擴(kuò)增基因二條鏈的兩端互補(bǔ)。在DNA模板變性成單鏈后，兩個(gè)引物分別與單鏈DNA復(fù)性，在耐熱的Taq

polymerse及4種脫氧核苷酸存在下，由引物引導(dǎo)合成DNA新鏈。3個(gè)步驟：變性94-95℃,雙鏈變性成單鏈復(fù)性50-70℃,兩個(gè)引物分別與單鏈DNA互補(bǔ)延伸72℃,在引物Taq酶的作用下從5'→3'的方向合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。PCR反應(yīng)常有25－35個(gè)循環(huán)經(jīng)過25個(gè)循環(huán)以后，理論上原來一個(gè)分子DNA可以擴(kuò)增為106個(gè)拷貝。僅用少量的模板DNA分子，可以得到大量擴(kuò)增產(chǎn)物。通常可以擴(kuò)增5kb左右的DNA片段。性能更好的Taq酶可以擴(kuò)增長達(dá)40kb的DNA片段。PCR擴(kuò)增的DNA序列經(jīng)過核酸序列測定分析后，可作為基因工程的目的基因。PCR循環(huán)數(shù)與產(chǎn)物拷貝數(shù)之間的關(guān)系PCR技術(shù)的關(guān)鍵人工合成寡核苷酸片段（引物）耐熱的TaqDNApolymerase

（來自Thermus

aquaticus，94kDa）PCR方法已成為分子生物學(xué)研究常規(guī)手段而且還用于遺傳、發(fā)育、進(jìn)化、疾病診斷、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域PCR技術(shù)的發(fā)明是現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展史上的又一個(gè)里程碑發(fā)明人獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)（三）人工合成基因根據(jù)已知的基因序列，或根據(jù)氨基酸序列推測DNA序列將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來，可以很快地人工合成基因。首先化學(xué)合成多個(gè)含有80－100個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸每個(gè)寡聚核苷酸片段之間有19－24個(gè)核苷酸的重疊序列再將各個(gè)寡聚核苷酸等量(摩爾濃度)混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡聚核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補(bǔ)齊成為雙鏈。再用兩個(gè)PCR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出DNA片段。若將兩個(gè)DNA片段放在一起，經(jīng)SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)擴(kuò)增出完整的基因片段（四）T－DNA標(biāo)簽克隆基因利用T－DNA插入創(chuàng)造突變體獲得突變體的純合材料分析突變體性狀與T－DNA的共分離關(guān)系PCR獲得T－DNA的側(cè)翼基因組序列用所得序列作探針篩選基因文庫，獲得目標(biāo)基因或克隆再作進(jìn)一步的分析T－DNA標(biāo)簽克隆基因的基本原理構(gòu)建T－DNA載體轉(zhuǎn)化植物（T1，T－DNA雜合體）篩選T2，獲得突變體尋找與T－DNA共分離的個(gè)體讓其自交，產(chǎn)生純合體PCR獲得T－DNA兩側(cè)的基因組序列利用側(cè)翼DNA序列作探針從DNA文庫中釣取基因基因功能驗(yàn)證（遺傳互補(bǔ)測驗(yàn)，用分離的野生基因轉(zhuǎn)化突變體，恢復(fù)功能）重組DNA分子的構(gòu)建用相同的內(nèi)切酶酶解目的基因與載體將載體與目的基因混合用DNAligase連接重組DNA分子的構(gòu)建§5外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞將目的基因與載體連接，構(gòu)建重組DNA分子重組DNA分子必須導(dǎo)入宿主細(xì)胞才能擴(kuò)增或表達(dá)重組DNA導(dǎo)入原核生物原核生物基因工程的受體通常是大腸桿菌導(dǎo)入方式多用轉(zhuǎn)化法也有用結(jié)合的方法重組DNA導(dǎo)入植物1、根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)2、基因槍法根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium

tumefaciens)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化是應(yīng)用得最早而廣泛的一種植物轉(zhuǎn)化方法。雙子葉植物、單子葉植物都可以用。將目的基因與花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子及終止子組成嵌合DNA分子插