不同氮源對(duì)蘋(píng)果白術(shù)發(fā)酵過(guò)程的影響

蘋(píng)果是由飲酒和提取的新果酒精蒸餾而成的。酵母菌在蘋(píng)果白蘭地發(fā)酵過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,其發(fā)酵力的好壞,副產(chǎn)物的多少,不僅直接影響產(chǎn)量的高低,而且間接影響產(chǎn)品風(fēng)味。目前在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵緩慢甚至停滯現(xiàn)象仍然是很普遍的問(wèn)題。因此尋找解決蘋(píng)果白蘭地發(fā)酵中糖的利用率和糖酒轉(zhuǎn)化率的方法是亟待解決的問(wèn)題。氮源是酵母生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一,蘋(píng)果汁中含有足夠酵母生長(zhǎng)所必須的碳水化合物,但氮源含量較低,不足以滿(mǎn)足釀酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng),從而會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵酒精度低殘?zhí)橇扛叩默F(xiàn)象。因此在發(fā)酵中添加適宜的氮源,將會(huì)有利于酵母的生長(zhǎng)及提高蘋(píng)果白蘭地的產(chǎn)量和質(zhì)量,降低成本,提高經(jīng)濟(jì)效益。本工作以氯化銨、蛋白胨、磷酸氫二銨、L-精氨酸為研究對(duì)象,研究氮源種類(lèi)及濃度對(duì)蘋(píng)果白蘭地酒精發(fā)酵的影響,以期為蘋(píng)果白蘭地發(fā)酵提供一種新方法,為氮源在發(fā)酵中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。1材料和方法1.1材料和分析方法釀酒酵母1023和1620由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供;斜面培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯20%,葡萄糖2%,瓊脂2%,pH自然);種子培養(yǎng)基采用PDA液體培養(yǎng)基(裝液量100mL/250mL,pH自然);富士蘋(píng)果采自于甘肅慶陽(yáng)靜寧縣;氯化銨分析純,天津奧博凱化工有限公司;蛋白胨生化試劑,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;磷酸氫二銨分析純,天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;L-精氨酸生化試劑,天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;焦亞硫酸鈉分析純,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。2WY-2102型恒溫培養(yǎng)箱、ZHJH-C11128型超凈工作臺(tái)上海智城分析儀器制造有限公司;TD50002型電子天平余姚市金諾天平儀器有限公司;B204LED型生物顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限公司;YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;RE5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;Breville-BJE500F型榨汁機(jī)澳大利亞鉑富公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1工藝1.2.2存儲(chǔ)液的制備將釀酒酵母保藏菌種轉(zhuǎn)接于新鮮試管斜面,28℃培養(yǎng)48h;4℃冰箱保存?zhèn)溆?。從保存的斜面培養(yǎng)基中用接種環(huán)挑去6環(huán)菌苔接種于裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,28℃、150r/min搖床培養(yǎng)48h,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.3氮源種類(lèi)對(duì)裝復(fù)量的影響在蘋(píng)果白蘭地酒發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的氯化銨、蛋白胨、磷酸氫二銨、L-精氨酸作為氮源,每種氮源設(shè)置對(duì)照、100、150、250、400、550、700mg/L七個(gè)水平,分別裝于1000mL三角瓶,每瓶600mL,重復(fù)3次。1.2.4蘋(píng)果白蘭地酒發(fā)酵培養(yǎng)制度將活化好的兩種釀酒酵母按照1∶1比例接種于600mL蘋(píng)果白蘭地酒發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為6%,接種濃度為106cfu/mL,然后于20℃下厭氧靜置發(fā)酵6d。1.2.5分析1.2.5.1.糖、總酸和酒精的測(cè)定依據(jù)GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對(duì)糖量、總酸、酒精度等理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。1.2.5.酵母發(fā)酵力的測(cè)定采用失重法,以單位體積和時(shí)間下二氧化碳揮發(fā)產(chǎn)生的失重來(lái)衡量酵母發(fā)酵力的大小,即酵母發(fā)酵力(g/(L·h))=(發(fā)酵前稱(chēng)重-發(fā)酵后稱(chēng)重)/(發(fā)酵液體積·發(fā)酵時(shí)間)。1.2.6數(shù)據(jù)分析2結(jié)果與分析2.1對(duì)二氧化碳釋放的影響酵母發(fā)酵力是指酵母產(chǎn)酒精的能力,在厭氧條件下酵母產(chǎn)生酒精與二氧化碳,發(fā)酵結(jié)束二氧化碳揮發(fā)產(chǎn)生失重,以失重來(lái)衡量酵母發(fā)酵力的強(qiáng)弱。不同氮源處理對(duì)蘋(píng)果白蘭地酒精發(fā)酵力的影響如圖1~圖4所示。由圖1~圖4可知,各處理的酵母發(fā)酵力均顯著高于對(duì)照(p<0.05),其中,氯化銨處理為250mg/L時(shí)二氧化碳釋放量最大,而與700、550、400mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05);蛋白胨處理為400mg/L時(shí)二氧化碳釋放量最大,與150、100mg/L及對(duì)照濃度處理相比差異顯著(p<0.05);磷酸氫二銨處理為250mg/L時(shí)二氧化碳釋放量最大,與550、400mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05);L-精氨酸處理為550mg/L時(shí)二氧化碳釋放量最大,而與250mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05)。由圖1~圖4可知,與對(duì)照二氧化碳失重量較低,相比較,添加氮源可以明顯加快發(fā)酵速度,增加二氧化碳失重量,提高酵母酒精發(fā)酵力,且無(wú)機(jī)氮源酵母酒精發(fā)酵力低于有機(jī)氮源。2.2其他處理殘?zhí)橇繗執(zhí)鞘蔷凭l(fā)酵后未被發(fā)酵而殘余的糖,殘?zhí)歉叩褪呛饬烤凭l(fā)酵完全程度的重要指標(biāo)。殘?zhí)瞧咭馕吨a(chǎn)酒率偏低,糖不能有效地轉(zhuǎn)化為酒精。不同氮源處理對(duì)蘋(píng)果白蘭地酒精發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊懭鐖D5~圖8所示。由圖5~圖8可以看出,除了蛋白胨100mg/L處理對(duì)殘?zhí)堑挠绊懪c對(duì)照無(wú)明顯差異外,其他三個(gè)處理的各個(gè)濃度與對(duì)照相比差異均顯著(p<0.05)。其中,氯化銨和磷酸氫二銨添加量均為250mg/L時(shí)殘?zhí)橇孔钚?但250mg/L氯化銨與550、400mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05),250mg/L磷酸氫二銨與400mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05);蛋白胨添加量為400mg/L時(shí)殘?zhí)橇孔钚?與550mg/L差異不顯著(p>0.05);而L-精氨酸處理為550mg/L時(shí)殘?zhí)橇孔钚?與700、250mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,同空白對(duì)照降糖較慢相比,添加氮源可以加速糖的降解,提高糖酒轉(zhuǎn)化率,增加酒精產(chǎn)量。從圖5~圖8中還可以看出發(fā)酵后糖利用率整體偏低,經(jīng)分析認(rèn)為可能是初始發(fā)酵糖度過(guò)高,隨著酒精濃度的增加,酵母容易受到高濃度酒精的抑制,從而不能充分利用發(fā)酵液中的糖,導(dǎo)致糖利用率偏低。2.3發(fā)酵溫度和氮源濃度對(duì)發(fā)酵酒精度的影響酒精度表示酒中含乙醇的體積百分?jǐn)?shù),體積百分?jǐn)?shù)越大,說(shuō)明酵母發(fā)酵糖產(chǎn)生的乙醇越多。不同氮源處理對(duì)蘋(píng)果白蘭地發(fā)酵酒精度的影響如圖9~圖12所示。從圖9~圖12結(jié)果可以看出,除了蛋白胨及磷酸氫二銨100mg/L處理的酒精度分別低于、與對(duì)照無(wú)差異以外,其他各處理的酒精度均顯著高于對(duì)照(p<0.05),其中,氯化銨和磷酸氫二銨處理都為250mg/L時(shí)酒精度最高,但氯化銨與400mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05),而磷酸氫二銨則與700、400、150mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05);蛋白胨處理為400mg/L時(shí)酒精度最高,與700、550mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05);而L-精氨酸處理為550mg/L時(shí)酒精度最高,與700、250mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05)。由圖9~圖12結(jié)果可知,在相同的發(fā)酵條件下,無(wú)機(jī)氮源發(fā)酵酒精度低于有機(jī)氮源,其中無(wú)機(jī)氮源中以氯化銨在水平250mg/L下酒精度最高,有機(jī)氮源中以蛋白胨在水平400mg/L下酒精度最高。因?yàn)樘O(píng)果汁中氮的含量是影響酵母生長(zhǎng)及發(fā)酵速率的主要因素,低溫發(fā)酵時(shí)有機(jī)氮源氨基酸在酵母對(duì)數(shù)期時(shí)可被大部分利用,而無(wú)機(jī)氮源更多的是用于酵母生物量的生成。Beltran等的研究結(jié)果表明,有機(jī)氮源氨基酸在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中對(duì)酵母細(xì)胞代謝非常重要,而無(wú)機(jī)氮源銨鹽則在發(fā)酵后期很難被利用,以上研究結(jié)果支持本實(shí)驗(yàn)有機(jī)氮源發(fā)酵酒精度高于無(wú)機(jī)氮源的結(jié)果。以上結(jié)果還表明,氮源濃度在150mg/L以上發(fā)酵酒精度與對(duì)照相比有顯著差異,但隨著氮源濃度的增加,酒精含量并不與氮源濃度呈直線關(guān)系。氮源不足會(huì)導(dǎo)致酒精發(fā)酵緩慢甚至停滯現(xiàn)象的發(fā)生,其他一些研究證實(shí),防止發(fā)酵不徹底的氮源最小值大概是140mg/L,而在實(shí)際發(fā)酵中,氮源的最小值還受酵母菌種、生長(zhǎng)繁殖條件及發(fā)酵環(huán)境的影響,這個(gè)結(jié)論只是一個(gè)粗略估計(jì)。而足量的氮源可以提高酵母菌的發(fā)酵速率并可以縮短發(fā)酵周期,但氮源濃度過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致酒精度的下降,因?yàn)榈礉舛冗^(guò)高會(huì)使發(fā)酵過(guò)程出現(xiàn)氮分解代謝產(chǎn)物阻遏(NCR)狀態(tài),而此狀態(tài)會(huì)降低銨鹽和氨基酸透性酶基因(GAP1和MEP2)的表達(dá),影響細(xì)胞對(duì)氮源的轉(zhuǎn)移及吸收,由于NCR狀態(tài)下氮與糖的代謝高度相關(guān),同樣也會(huì)影響糖代謝進(jìn)而不利于酒精的積累,同時(shí)過(guò)量的氮源會(huì)造成微生物危害及生物胺生成,對(duì)酒的穩(wěn)定性及品質(zhì)產(chǎn)生消極影響。2.4不同氮源、對(duì)總酸的影響蘋(píng)果白蘭地總酸是蘋(píng)果原汁酸和酵母代謝酸的總和,蘋(píng)果白蘭地總酸的高低,關(guān)系到蘋(píng)果白蘭地酒的質(zhì)量和口感,不同氮源處理對(duì)蘋(píng)果白蘭地酒精發(fā)酵總酸的影響如圖13所示?？偹嶙兓渴侵柑O(píng)果白蘭地酒發(fā)酵前后總酸含量的差值,本實(shí)驗(yàn)在蘋(píng)果白蘭地酒發(fā)酵過(guò)程中,處理及對(duì)照總酸變化量都有所增加。由圖13可以看出,無(wú)機(jī)氮源發(fā)酵后總酸變化量較有機(jī)氮源明顯,個(gè)別濃度處理的總酸變化量與對(duì)照相比差異顯著(p<0.05),并隨著氮源濃度增加總酸變化量有增加的趨勢(shì),經(jīng)分析認(rèn)為氯化銨和磷酸氫二銨都是生理酸性氮源,氨氮利用后游離出來(lái)的酸根使發(fā)酵后總酸增加;而有機(jī)氮源不同濃度處理后的總酸變化量與對(duì)照相比,不但沒(méi)有顯著增加,反而多數(shù)濃度處理后的總酸變化量低于對(duì)照。因此,酒精發(fā)酵過(guò)程中,總酸可以受到不同氮源及濃度的影響。3發(fā)酵過(guò)程中酵母粉添加量的變化3.1蘋(píng)果白蘭地酒精發(fā)酵中適當(dāng)添加氮源對(duì)蘋(píng)果白蘭地酒發(fā)酵有一定促進(jìn)作用。在相同的發(fā)酵條件下,添加氮源可以提高酵母酒精發(fā)酵力,加速糖的降解,提高糖的轉(zhuǎn)化率。3.2無(wú)機(jī)氮源發(fā)酵酒精度低于有機(jī)氮源,添加氮源后,氮源濃度在150mg/L以上發(fā)酵酒精度與對(duì)照差異顯著,但隨著氮源濃度的增加,酒精含量并不與氮源濃度呈直線關(guān)系,其中無(wú)機(jī)氮源中以氯化銨在水平250mg/L下酒精度最高,有機(jī)氮源中以蛋白胨在水平400mg/L下酒精度最高。3.3發(fā)酵過(guò)程中總酸的變化受蘋(píng)果汁中氮源種類(lèi)及濃度的影響,無(wú)機(jī)氮