野生冬蟲夏草與蟲草核苷類成分的比較研究

中國的地理位置和自然條件非常好，富含豐富的細(xì)菌資源。到目前為止,我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)720多種食用菌,分別歸屬于144個屬,46個科。其中多數(shù)屬于擔(dān)子菌亞門,如香菇、草菇、蘑菇、木耳等;少數(shù)屬于子囊菌亞門,如羊肚菌、馬鞍菌、北冬蟲夏草、冬蟲夏草等。隨著人們生活水平提高、保健意識增強,傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草由于其功效卓越,作用溫和,受到越來越多的關(guān)注,對它的研究也成為世界科學(xué)家們關(guān)注的焦點。1青藏高原的現(xiàn)狀及人工替代1.1對全球變化和人類活動的擾動冬蟲夏草分布區(qū)自然生態(tài)條件嚴(yán)酷,其載體高寒草地生態(tài)系統(tǒng)極其脆弱。它對全球變化和人類活動的擾動極其敏感。如果對冬蟲夏草資源過度采挖。不僅會對冬蟲夏草賴以生存的高寒草地生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響,而且最終導(dǎo)致冬蟲夏草因生態(tài)環(huán)境惡化而其分布區(qū)變小,資源逐漸枯竭。1.2人工選擇食物1.2.1性生物培育的意義目前,有性型全人工培植冬蟲夏草沒有解決蟲與菌接種和批量、重復(fù)長出子座體的難關(guān),離小面積、小批量、多次重復(fù)在低海拔人工培育出有性型冬蟲夏草的目標(biāo)都還十分遙遠(yuǎn)。由于野生冬蟲夏草的宿主蝙蝠蛾幼蟲對生長環(huán)境要求很苛刻,人工模擬的野生環(huán)境極難控制,野生冬蟲夏草在人工環(huán)境下難以工廠化批量生長。1.2.2種新菌粉的發(fā)酵蟲草菌無性型培養(yǎng)技術(shù)容易掌握,從自然界采集冬蟲夏草分離出來的真菌,絕大部分理化性質(zhì)和藥理功能與冬蟲夏草的有性成分相似,全世界不少機構(gòu)都把自我分離出的真菌確定為冬蟲夏草菌的無性階段,并紛紛建廠生產(chǎn)菌粉和開發(fā)應(yīng)用。目前已從自然界的冬蟲夏草體中分離出中華蟲草菌無性型若干種,進行深層大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)和固體培養(yǎng)菌絲體和分生孢子體作為有性型冬蟲夏草的代用品,部分廠家已進入大的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。2北雜草的特點全世界目前已發(fā)現(xiàn)大約350種蟲草,它們形態(tài)各異,寄主也各不相同。唯有主產(chǎn)于我國的冬蟲夏草和北冬蟲夏草最具藥用和食用價值。北冬蟲夏草與冬蟲夏草比較有以下幾個特點:(1)北冬蟲夏草為蟲草屬的模式種,分布廣泛,為世界各國學(xué)者所認(rèn)識和接受。(2)北冬蟲夏草已經(jīng)形成了在人工條件下育成完整子座的成熟工藝。(3)北冬蟲夏草具有高含量的蟲草素和蟲草多糖,其獨特藥理作用已日益引起藥學(xué)界的高度重視。北冬蟲夏草中有效成分種類與冬蟲夏草相近,前者中有些成分含量甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后者。3食用菌多糖和腺苷類物質(zhì)和菌株素食用菌中的功效成分包括多糖類、核苷類、多肽氨基酸類、三萜類和脂肪類等。其中多糖和腺苷類物質(zhì)是大多數(shù)食用菌都具有的重要成分,蟲草屬的真菌還含有一種獨特的核苷類功效成分——蟲草素。為了確定具體12種常見食用菌的主要功效成分,將不同來源的12種常見食用菌進行功效成分含量的測定與比較。3.1實驗原材料3.2采用液相聯(lián)法測定了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎植物屬的主要活性成分3.2.1實驗設(shè)備a.API400型質(zhì)譜儀;b.安捷倫1100型液相色譜儀;c.2487UV雙波長檢測器;d.離心機。3.2.2水-甲醇體系色譜條件:色譜柱XB-C18,5μm,4.6*250mm;檢測波長258nm;流速1.0mL/min;進樣量20μL;流動相:含0.5%乙酸的水-甲醇(95/5,V/V)體系。質(zhì)譜條件:MS:200~400(aum),cur:12,GS1:30psi,GS2:30psi,2s,500V,TEM:300℃,DP:40V,EP:8V,進樣量5μL。3.3通過測定和分析不同細(xì)菌下糖、腺苷和甘草的含量經(jīng)比較選取了合適的方法對樣品進行多糖、腺苷和蟲草素含量的測定。3.3.1多酚測定按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1676-2008,對樣品中的總多糖進行測定。3.3.2流動相3.2按照高效液相色譜法(藥典2000版附錄VID)色譜條件:色譜柱XB-C18,5μm,4.6*250mm;檢測波長260nm;流速1.0mL/min;進樣量20μL;流動相:磷酸鹽緩沖液(pH6.5):甲醇(17:3,V/V)體系。腺苷平均加樣回收率為100.23%,RSD=1.35%。3.3.3測定方法依照高效液相色譜法(藥典2000版附錄VID)色譜條件:色譜柱XB-C18,5μm,4.6*250mm;檢測波長258nm;流速1.0mL/min;進樣量20μL;流動相:含0.5%乙酸的水-甲醇(95/5,V/V)體系。蟲草素平均加樣回收率為99.72%,RSD=1.43%。3.4對結(jié)果的分析與討論3.4.1牧草素和腺苷的含量測定經(jīng)LC-MS組分定性、質(zhì)譜圖比對,在268.0和251.9都出現(xiàn)了質(zhì)譜峰,說明國寶北冬蟲夏草中的兩個主要功效成分與野生冬蟲夏草中的特有活性成分蟲草素和腺苷的核質(zhì)比一致。經(jīng)過與文獻中野生冬蟲夏草的質(zhì)譜峰對比一致,表明國寶北冬蟲夏草中也含有冬蟲夏草中的特有活性成分蟲草素和腺苷。3.4.2草與蟲部位及多糖含量的比較由表3-2可以看出:(1)腺苷普遍存在于常見食用菌中,并且根據(jù)食用菌種類的不同腺苷含量各有高低。(2)本實驗收集了我國南方、北方、野生、人工培育的各種食用菌分部位進行腺苷含量測定,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)傘菌的食用菌其菌傘部位的腺苷含量高于菌柄部位的腺苷含量,一般菌傘腺苷含量為菌柄腺苷含量的1-4倍。(3)蟲草屬真菌的分部位含量測定比較則是按草和蟲兩個部位來劃分的,其中野生冬蟲夏草中的腺苷主要存在于草的部分,蟲的部分腺苷含量較低,前者約為后者的3-4倍。國寶北冬蟲夏草子實體中的腺苷為0.070%,與西藏蟲草(草部位)的0.069%和青海蟲草(草部位)的0.071%相近。另外,表3-2結(jié)果表明:蟲草素作為蟲草屬真菌的特有功效成分,僅存在于冬蟲夏草和北冬蟲夏草這兩個蟲草屬中,在其他食用菌中均未檢出。野生冬蟲夏草的蟲草素含量較低,約為0.10%左右,但從實驗結(jié)果可以看到草部位比蟲部位的蟲草素含量高。野生北冬蟲夏草中的蟲草素含量是冬蟲夏草的10倍左右,而國寶北冬蟲夏草子實體中的蟲草素含量為1.92%,是野生北冬蟲夏草的15倍,超過冬蟲夏草150倍。各地各屬種食用菌中的多糖含量都比較高,基本都在10%以上,有的食用菌,如小青蘑、雞腿蘑甚至超過20%接近30%。通過對傘菌(擔(dān)子菌亞門)的菌傘和菌柄多糖含量測定比較發(fā)現(xiàn),大多數(shù)菌柄中的多糖含量近似等于或略高于菌傘中的多糖含量,前者約為后者的1-1.5倍。而對蟲草屬的真菌進行檢測后發(fā)現(xiàn),野生北冬蟲夏草、國寶北冬蟲夏草的多糖含量與野生冬蟲夏草多糖含量相當(dāng),都在10%-13%之間。4雜草素的活性成分由于野生冬蟲夏草對生長環(huán)境要求苛刻,并且用人工替代培育野生冬蟲夏草效果不佳,通過對野生冬蟲夏草和北冬蟲夏草的LC-MS組分定性、質(zhì)譜圖比對,證實國寶北冬蟲夏草中的兩個主要功效成分與野生冬蟲夏草中的特有活性成分蟲草素和腺苷的核質(zhì)比一致。通過對各菌菇中多糖、腺苷和蟲草素的含量測定,表明,腺苷普遍存在于常見食用菌中,許多真菌和植物都含有活性多糖,蟲草酸又稱為D-甘露醇,僅是普通生化物質(zhì)。只有蟲草素,作為蟲草屬真菌的特有功效成分,僅存在于冬蟲夏草和北冬蟲夏草中,是其它食用真菌所不含有的。蟲草素作為一種重要的生物活性物質(zhì),一直缺乏有利開發(fā)。究其原因,一方面是由于生產(chǎn)者對蟲草素這一重要活性成分重視程度不夠,另一方面也是因為目前尚無相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)冬蟲夏草及北冬蟲夏草中蟲草素的含量。國寶北冬蟲夏草與野生冬蟲夏草中的真菌多糖含量相當(dāng),腺苷含量國寶北冬蟲夏草高于野生蟲草,特有功效成分蟲草素含量國寶北冬蟲夏草遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生蟲草,而且國寶北冬蟲夏草培育周期短,人工培育技術(shù)成熟,可以大規(guī)模生產(chǎn),是實現(xiàn)野生冬蟲夏草工廠化培育的最佳替代品。研究表明,蟲草素具有抗腫瘤、抗