固相萃取-高效液相色譜法測定兒童尿液中鄰苯二甲酸單酯

二甲酸酯，也被稱為塑料劑，是一種廣泛用于合成的化學(xué)品。它主要用于工業(yè)、藥物和消費品，也用作溶劑和塑料制品的原料增劑。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBzP)主要用于增加PVC地板、醫(yī)藥管材和食品包裝材料等塑料制品的可塑性,而鄰苯二甲酸二正丁酯((DBP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP),則主要用于個人洗護(hù)產(chǎn)品(如香水、洗滌劑、化妝品等),作為醋酸纖維素材料的溶劑或增塑劑,還可用于生產(chǎn)罐頭包裝涂料、油漆和生產(chǎn)具有緩釋作用的藥物包衣。通常人們通過飲食、呼吸、皮膚接觸和靜脈注射等途徑攝入鄰苯二甲酸酯。鄰苯二甲酸酯進(jìn)入人體后,由于其生物半衰期較短,會迅速代謝并隨尿液或糞便排出體外。鄰苯二甲酸酯在人體中的代謝分為2個階段:首先相對極性和分子量較低的鄰苯二甲酸酯(如DBP)主要通過水解一個酯基代謝為對應(yīng)的水解單酯(MBP),而高分子量的鄰苯二甲酸酯(如DEHP)則進(jìn)一步代謝生成對應(yīng)的氧化單酯,部分水解單酯和氧化單酯隨尿液或糞便排出,另一部分單酯則通過進(jìn)一步的生物轉(zhuǎn)化形成水溶性更強的葡糖甘酸結(jié)合物。鄰苯二甲酸酯是一類內(nèi)分泌干擾物,對人類可能具有生殖和發(fā)育毒性,導(dǎo)致哮喘和過敏發(fā)病率增加及甲狀腺毒性、肝臟毒性和急性刺激效應(yīng)。鄰苯二甲酸酯代謝物與人體體重指數(shù)和腰圍呈正相關(guān),可能增加女性患糖尿病的幾率,已有研究表明DEHP與其代謝產(chǎn)物MEHP降低了雌二醇、睪丸酮等固醇類激素的生物合成,流行病學(xué)研究表明MBP、MBzP和MEHP會影響兒童控制甲狀腺激素合成基因的表達(dá),因此關(guān)于人體鄰苯二甲酸酯暴露水平的研究引起了廣泛關(guān)注,而DBP、BBzP和DEHP作為應(yīng)用廣泛、毒性較大的幾種鄰苯二甲酸酯更是研究的重點。由于鄰苯二甲酸酯廣泛存在于環(huán)境中,取樣污染很難避免,導(dǎo)致人體暴露水平遠(yuǎn)低于取樣帶來的污染,而測定鄰苯二甲酸酯進(jìn)入體內(nèi)后的代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單酯可將取樣帶來的污染最小化,鄰苯二甲酸單酯可在多種生物樣本(如尿液、母乳、唾液、血清等)中檢測到。已有研究表明,鄰苯二甲酸單酯在人體體液中的檢出量是尿液>血清>母乳和唾液,因此本研究取尿樣進(jìn)行檢測。本文對尿液中鄰苯二甲酸單酯的檢測法進(jìn)行優(yōu)化,采用WatersOASISHLB固相萃取柱,其中填料是水可浸潤性反相吸附劑且適用的洗脫液pH范圍較寬,具有良好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性,其中3mL/60mg的SPE柱(SolidPhaseExtraction)作用是保留在堿性條件下疏水的物質(zhì),同時盡可能多的洗脫尿液樣品中的酸性物質(zhì),6mL/200mg的SPE柱的作用是將尿液樣品中的鄰苯二甲酸單酯富集,進(jìn)一步去除其中的水溶性雜質(zhì)。檢測方法是高效液相色譜法,色譜柱為苯基柱,替代了傳統(tǒng)使用的C18柱,能夠更有效的分離鄰苯二甲酸單酯,為研究兒童的鄰苯二甲酸酯暴露水平提供參考。1材料和方法1.1色譜-質(zhì)譜條件Waters2695。高效液相色譜,2489紫外檢測器,GP-Phenyl120A型色譜(4.6mm×250mm,5μm,美國賽分科技有限公司),WatersOASISHLB固相萃取柱(3mL/60mg和6mL/200mg),12位負(fù)壓固相萃取裝置(天津艾杰爾有限公司),DC12型氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。1.2試劑1.2.1鄰苯二甲酸酯/mehp的合成鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)、鄰苯二甲酸單芐基酯(MBzP)、鄰苯二甲酸(2-乙基己基)單酯(MEHP)(美國Accustandard公司),純度均≥99%。1.2.2試劑:乙腈、高純水、磷酸質(zhì)酸鈉、磷酸鹽酸鈉;乙酸乙酯、磷酸乙酯、磷酸乙酯、磷酸鈉、磷酸乙酸鈉、總酸鈉;乙酸乙酯,總氨酸鈉試劑,苯酸二氫鈉樣品2-表1β-葡糖甘酸酶來自大腸桿菌(125KU,美國Sigma-Aldrich公司),乙腈、高純水、冰醋酸(色譜純試劑),乙酸乙酯、醋酸銨、磷酸二氫鈉、85%的磷酸,30%的氨水溶液(分析純試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。1.3試劑的制備1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液稱量MBP、MBzP、MEHP各0.1g,分別用乙腈溶解并定容至50mL,配制成2g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,置于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?.3.2-葡萄糖甘酸酶溶液稱取12mgβ-葡糖甘酸酶,用高純水溶解并定容至100mL,得200U/mL的β-葡糖甘酸酶溶液,儲存于-20℃冰箱中。1.3.3堿性緩沖液量取1mL30%NH3·H2O于體積比為50∶50的乙腈∶水(200mL)中,常溫保存,1周后需重新配制。1.3.4h3po4溶液0.14mol的NaH2PO4的溶液100mL、1%的H3PO4溶液100mL,將2種溶液混合并控制pH=2.0±0.1,室溫下儲存,1個月后需重新配制。1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制量取MBP、MBzP、MEHP的2g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液各5mL,用乙腈溶解并定容至100mL,配制成100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,利用上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用乙腈稀釋配制成20、100、500、2000、4000、10000μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,依照上述色譜條件進(jìn)樣,得到譜圖,繪制以濃度(x)對峰面積(y)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.5樣品采集和預(yù)處理1.5.1學(xué)校管理部門的知情同意書選擇上海市普陀區(qū)某小學(xué)9~12歲的健康學(xué)生150名,由老師簽署知情同意書后取其晨尿約30mL于棕色帶塞玻璃瓶(無水乙醇浸泡,烘干)中,迅速帶回實驗室并儲存于-20℃冰箱中。1.5.2葡萄糖苷酸酶解葡萄糖固糖單酯將尿液樣品解凍,漩渦震蕩,取1mL于帶塞玻璃試管中,超聲處理5min,然后加入醋酸銨溶液250μL,葡萄糖苷酸酶溶液(200U/mL)5μL,輕輕搖勻,置于37℃水浴中加熱90min,以使葡萄糖甘酸結(jié)合單酯完全水解為單酯,酶解結(jié)束后,向樣品中加入1mL堿式溶液進(jìn)行稀釋,漩渦震蕩5s。1.5.3spe柱的制備SPE柱(3mL/60mg)中依次加入1mL乙腈和2mL堿式緩沖液進(jìn)行平衡,目的是完全浸潤填料并除去填料中的雜質(zhì),使柱內(nèi)環(huán)境呈堿性,以除去尿液中堿性條件下疏水的雜質(zhì),將上述稀釋過的樣品轉(zhuǎn)移至柱中,此過程流速控制在2mL/min以下,以使雜質(zhì)盡可能多的留在SPE柱上,收集洗脫液至玻璃試管中,然后用1mL堿式溶液洗脫柱中的物質(zhì)并收集洗脫液,目的是洗脫殘留在SPE柱中的鄰苯二甲酸單酯,向洗脫液中加入3mL酸式緩沖液酸化,并徹底混合。SPE柱(6mL/200mg)中依次加入1mL乙腈、1mL高純水和2mL酸式緩沖液進(jìn)行平衡,目的是完全浸潤填料并使柱內(nèi)環(huán)境呈酸性,利于尿液中的鄰苯二甲酸單酯富集到柱中,起到濃縮的目的,然后將酸化后的溶液移至柱中,流出液棄去,此過程控制流速在1mL/min左右,讓尿液中的鄰苯二甲酸單酯完全富集在柱中,然后加入3mL酸式緩沖液洗滌柱,9mL高純水除去柱中殘留的鹽。之后用2mL乙腈、4mL乙酸乙酯洗脫柱中的物質(zhì),洗脫液用高純氮氣在55℃下吹干,將殘留物質(zhì)用500μL乙腈溶解,經(jīng)0.45μm有機系微孔濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至液相進(jìn)樣瓶中,進(jìn)行高效液相色譜分析。1.6樣品量的確定流動相:乙腈(0.2%的乙酸)∶水(0.2%的乙酸)=45∶55,選擇波長228nm,流速0.8mL/min,進(jìn)樣量為20μL。2結(jié)果與分析2.1檢測波長的確定MBP、MBzP和MEHP的100mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用紫外可見分光光度計進(jìn)行波長掃描,得到波長與吸光度值的關(guān)系圖(圖1),從圖中看出該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在200~230nm處均有吸收,最大吸收波長則出現(xiàn)在203nm附近,考慮到許多烴類物質(zhì)在200~210nm左右會產(chǎn)生吸收,可能對鄰苯二甲酸單酯類物質(zhì)的檢測產(chǎn)生干擾作用,故選擇228nm作為檢測波長。2.2加標(biāo)回收率的測定洗脫體積是影響固相萃取回收率的主要因素之一,因此本實驗研究洗脫體積對回收率的影響(表1)。量取0.5mL500μg/L的鄰苯二甲酸單酯混合標(biāo)準(zhǔn)液于含1mL高純水的試管中,按照上述固相萃取條件進(jìn)行前處理,在其他操作不變的基礎(chǔ)上,改變最后洗脫時溶劑體積配比,每種體積配比做3個平行樣,計算回收率。根據(jù)表1得出,2mL乙腈/2mL乙酸乙酯進(jìn)行洗脫回收率偏低,增加乙酸乙酯的用量洗脫回收率明顯提高,而同時增加乙腈和乙酸乙酯的量發(fā)現(xiàn)回收率變化不大,因此2mL乙腈/4mL乙酸乙酯的用量既保證了回收率,又減少了有機溶劑的使用,還可縮短氮吹時間,是理想的洗脫溶劑體積配比。2.3hplc載液的制備鄰苯二甲酸單酯是中等極性的物質(zhì),易溶于有機溶劑,如甲醇、乙腈等,在水中的溶解度則與分子量大小有關(guān),分子量較小的如MBP溶于水,但分子量較大的如MEHP在水中是溶解度有限,故選擇有機溶劑作為HPLC的載液。由于乙腈是流動相之一,選擇乙腈作為載液,保留時間如表2所示,出峰順序為:MBP、MBzP、MEHP。2.4限和表2所限兒童尿液中3種鄰苯二甲酸單酯的固相萃取,高相液相色譜法的線性方程、相關(guān)系數(shù)與檢測限如表2。表2可見,在20~10000μg/L的線性范圍內(nèi),所得的這3種鄰苯二甲酸單酯的回歸方程均呈較好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R≥0.99,檢出限分別為:MBP9.50μg/L,MBzP10.50μg/L,MEHP12.50μg/L。2.5加標(biāo)回收率的測定分別取1mL尿液樣品加入20、500、4000μg/LMBP、MBzP、MEHP的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL,每個濃度共3個平行樣,按照固相萃取-高效液相色譜的條件進(jìn)行處理和進(jìn)樣,得出的樣品加標(biāo)回收率見表3。表3得出,該方法所得的3種單酯的樣品加標(biāo)平均回收率在80.3%~90.15%之間,RSD為1.2%~3.62%,回收率均達(dá)到80%以上。2.6在制備樣品和飲料中的應(yīng)用150名兒童尿液樣品中常見的3種鄰苯二甲酸單酯的檢測結(jié)果見表4。表4可見MBP在兒童尿液中的含量較少,可能由于DBP主要用于化妝品等,兒童接觸較少,而對于廣泛應(yīng)用于食品包材,室內(nèi)裝潢和兒童玩具等的BBzP其代謝物MBzP在兒童尿液中含量較多,DEHP的應(yīng)用雖廣泛,但尿液中MEHP的含量較少,可能由于其在人體中的代謝物除MEHP外,還生成其他幾種氧化單酯。表5可見,MBP在兒童尿液樣品中的檢出率較低,而MBzP、MEHP的檢出率較高,可能因兒童更廣泛的接觸到DEHP、BBzP。3單酯與鄰苯二甲酸酯的含量比較本研究主要建立了兒童尿液中常見的3種鄰苯二甲酸單酯的固相萃取-高效液相色譜測定法,并對方法的精密度及準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗證,結(jié)果表明此檢測方法具良好的線性關(guān)系,且精密度、準(zhǔn)確性與再現(xiàn)性較好,可作為兒童尿液中MBP、MBzP、MEHP3種鄰苯二甲酸單酯的定量檢測方法。本實驗測定了某小學(xué)9~12歲的150名兒童的尿液樣品,其中MBP檢出率為>68%,MBzP、MEHP檢出率為88%,由于鄰苯二甲酸酯廣泛應(yīng)用于日用品中,兒童可能通過各種途徑接觸到鄰苯二甲酸酯,而通過飲食攝入是最主要的一種途徑,尤其對于高分子量的鄰苯二甲酸酯(如DEHP、BBzP)。對于低分子量的鄰苯二甲酸酯(如DBP),呼吸室內(nèi)空氣和皮膚接觸是僅次于飲食攝入的重要暴露途徑。DEHP是生產(chǎn)應(yīng)用最廣泛的一種鄰苯二甲酸酯,但MEHP在樣品中含量較低,可能由于其暴露水平較低,或代謝產(chǎn)生的MEHP較少,有人體代謝研究表明:DEHP首先代謝產(chǎn)生MEHP,再進(jìn)一步氧化代謝產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物,鄰苯二甲酸(2-乙基-5-氧己基)單酯(MEOHP)、鄰苯二甲酸(2-乙基-5-羥基己基)單酯(MEHHP)這兩種氧化代謝產(chǎn)物在尿液中含量遠(yuǎn)大于MEHP含量,但美國NHANES(全國健康與營養(yǎng)檢查調(diào)查)數(shù)據(jù)顯示應(yīng)用MEHP作為反映DEHP暴露水平的生物指標(biāo)仍是有效可行的。MBP在兒童尿液中含量較少,可能由于兒童較少接觸含DEP的日用消費品(例如香水、香皂、清潔劑、化妝品等)。表5可見,女生尿液中MBP的檢出率和含量中位數(shù)均明顯高于男生,主要原因可能是女生接觸洗發(fā)水、護(hù)膚品等個人護(hù)理產(chǎn)品較多。TeitelbaumS等采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,對美國35位兒童尿液中的鄰苯二甲酸酯代謝物進(jìn)行檢測,其中常見的幾種單酯MBP、MBzP、MEHP的檢出率均達(dá)到97.5%以上,MBP含量的第50百分位數(shù)50th為55.7μg/L,而檢出的最大值為1187.4μg/L,本研究中MBP的第50百分位數(shù)50th為84.75μg/L,而檢出的最大值為2807μg/L,是上述研究的2倍左右,DBP的暴露情況國內(nèi)外基本一致,TeitelbaumS等人研究中MBzP、MEHP第50百分位數(shù)50th分別為37.8μg/L和11.3μg/L,而檢出的最大值分別為1038.6μg/L、272.7μg/L,本研究中第50百分位數(shù)50th為427.7μg/L和199.1μg/L,而檢出最大值分別為3076μg/L,1506.5μg/L,約為上述研究的10倍以上,說明國內(nèi)外因地理環(huán)境和鄰苯二甲酸酯BBzP、DEHP的使用情況差別較大