廣州市登革熱媒介白紋伊蚊的調(diào)查

登陸熱是由登陸病毒引起的急性傳染病，通常在熱帶和亞熱帶地區(qū)傳播。該病傳播迅速,常常引起大規(guī)模流行,在南亞和東南亞地區(qū)短期內(nèi)登革熱發(fā)病人數(shù)可達數(shù)十萬甚至上百萬。地處亞熱帶的廣州市是我國登革熱的主要發(fā)生地之一,近十余年來多次發(fā)生登革熱的暴發(fā)、流行,疫情嚴重時患者人數(shù)達數(shù)千人之多。雖然本病近年來已引起廣泛重視,但是有關登革熱在我國亞熱帶地區(qū)發(fā)生、流行的來源及特點等方面仍有許多問題值得探討和研究。為了了解廣州市自然界白紋伊蚊攜帶登革熱病毒情況,從2005年開始,我們開展了廣州市白紋伊蚊攜帶登革熱病毒情況的調(diào)查,首先由各個區(qū)縣疾控中心定期采集登革熱新舊疫點附近白紋伊蚊幼蟲標本,然后對這些蚊蟲標本進行登革熱病毒檢測?，F(xiàn)將3年來的監(jiān)測結果報告如下。1材料和方法1.1白紋伊蚊幼蟲本從廣州市11個行政區(qū)的自然環(huán)境(包括外環(huán)境和民居室內(nèi),以登革熱新舊疫點為主)里的各種類型積水中采集白紋伊蚊幼蟲標本,在實驗室用酵母粉人工飼養(yǎng)為成蚊。1.2病毒登格迪布陽性對照用登革熱病毒(廣州株)由本中心病毒免疫科提供。1.3en公司和tablesybrt-pcr試劑盒TRIzol試劑購于Invitrogen公司,One-stepSYBRGreenreal-timeRT-PCR試劑盒購于TaKaRa公司。1.4cttctctctctgctrtcactgctrtccttgctgcttgctgac3病毒檢測采用熒光RT-PCR方法,所用引物為自行設計,其核苷酸序列為:上游引物:5’CTTTCCTCTTTCCTGCTTGCTAAC3’;下游引物:5’ATCCGTGACCATGCTCCTTATG3’。擴增片段位于登革病毒E基因區(qū)域。1.5蚊子被檢測為攜帶登陸熱病毒1.5.1熒光定量rt-pcr檢測參照文獻介紹的方法:將蚊蟲冷凍麻醉后置于研磨杯中,加入1mlTRIzol試劑研磨后室溫靜置3min,再加入200μl氯仿,劇烈振蕩后靜置、離心,吸取上層水相轉移至另一離心管。加入等量異丙醇并混勻,室溫靜置后離心,棄上清;用75%乙醇洗滌,離心后去上清,真空干燥后溶解于20μl去RNase水中,立即進行RT-PCR。采用TaKaRa公司一步法熒光定量RT-PCR試劑盒,在MJ-Research公司熒光定量PCR儀上進行擴增。50μl反應體系中包含:PCR緩沖液25μl,逆轉錄酶0.5μl,Taq酶1μl,RNA酶抑制劑1μl,上、下游引物各1μl,RNA樣品5μl,加去離子水補齊余量。反應步驟為:42℃逆轉錄15min,95℃預熱5min,95℃熱變性10s,60℃退火及引物延伸20s,50個循環(huán)后結束反應并制作融解曲線。為保證實驗結果的可靠性,每次實驗均同時設置陽性對照(以廣州株登革熱病毒核酸為RT-PCR模板)和陰性對照(以純水為模板)。1.5.2序列分析出現(xiàn)陽性結果的PCR產(chǎn)物送大連寶生物公司進行序列測定,并對測序結果進行序列分析。2結果2.1病毒核酸陽性標本檢測2005~2007年,我們采用實時熒光RT-PCR方法總共檢測白紋伊蚊標本493批,平均每批大約10余只蚊蟲。分別在荔灣區(qū)逢源街(2006年8月)、從化市鄧村(2007年4月)、白云區(qū)云溪(2007年5月)等地檢出登革熱病毒核酸陽性標本。其中荔灣區(qū)逢源街和從化市鄧村標本的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)過序列測定證實為登革病毒Ⅰ型,而白云區(qū)云溪標本經(jīng)實時熒光RT-PCR方法檢測為陽性,但未能進行測序鑒定。2005年廣州未發(fā)生登革熱流行,白紋伊蚊標本主要采自廣州市城區(qū),以登革熱舊疫點為主。共采集蚊蟲標本2000余只,沒有檢測出陽性結果。2006年廣州市發(fā)生了較大規(guī)模的登革熱流行,蚊蟲標本主要采自登革熱疫點附近,共采集蚊蟲約2000只,其中在登革熱流行期采自疫點荔灣區(qū)逢源街的蚊蟲中檢出1份陽性標本。2007年廣州市沒有發(fā)生登革熱流行,僅有一些散發(fā)病例。在當年出現(xiàn)首例登革熱病例之前分別在采自從化市鄧村、白云區(qū)云溪的蚊蟲中檢出2例陽性標本,其中從化市鄧村是2006年登革熱的主要疫點之一。2.2測序結果荔灣區(qū)逢源街標本和從化鄧村標本測序結果相同,核苷酸序列為:5’CTTTCCTCTTTCCTGCTTGCTAACTATCATGTGCGGCTCTCCCCCTCGTGTGGTCAGATGGAACGCCAGGGCTGTGGGCAGCAGCATAAGGAGCATGGTCACGGAT3’。核苷酸序列分析:經(jīng)過BLAST軟件進行序列分析,證實該基因序列為登革熱病毒Ⅰ型序列。3基于檢測結果的登革熱病毒在非流行期的發(fā)生情況近年來,關于廣州地區(qū)登革熱流行的來源問題,多數(shù)報道認為首例病例均為輸入性的,本地發(fā)生的登革熱流行是由輸入病例繼發(fā)引起的。廣州市自然界蚊媒中是否長期存在登革熱病毒,在沒有登革熱病例輸入的情況下本地是否也可能發(fā)生登革熱流行的問題,一直沒有直接的證據(jù)對此作出回答。但是近年來廣州市登革熱流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn),在廣州發(fā)生的登革熱流行存在著同一地點多年反復發(fā)生的特點。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)一些登革熱患者發(fā)病前并無外出史,且在當?shù)匾矡o輸入性病例發(fā)生。這些現(xiàn)象提示人們,登革熱病毒有可能在廣州地區(qū)已經(jīng)長期存在于自然界中,并且能在適當條件下傳播給人群,造成登革熱的暴發(fā)、流行。而登革熱病毒在蚊蟲種群中的經(jīng)卵傳遞和經(jīng)交配傳遞能力以及登革熱病毒在滯育卵中的越冬能力則為這種觀點提供了理論依據(jù)。廣州市曾經(jīng)在2002年和2003年連續(xù)2年分別發(fā)生大規(guī)模和較大規(guī)模的登革熱流行,根據(jù)有關檢測結果,2002~2004年廣州地區(qū)流行的登革熱病毒株同源性完全一致,而與登革Ⅰ型病毒的國際標準株相應序列有95%的同源性。實驗結果表明,2002年疫情的登革熱病毒延續(xù)到2003年的可能性很大。在登革熱的非流行期,于野外采集的白紋伊蚊體內(nèi)檢出登革熱病毒核酸則為這種觀點提供了直