含rluc報(bào)告基因的登革4型病毒亞基因組復(fù)制子的構(gòu)建及鑒定

病毒位于黃毒科黃病毒科的重要成員。這是一個(gè)有膜的單帶正鏈鈉病毒。第五組大約有11kb長(zhǎng)，由5和3（utr）編碼區(qū)域和中間的單一開(kāi)放讀碼框組成，后者編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（c、prm、m，e）和七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5）。盡管登革病毒基因組UTR中存在的一些保守的線性序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)參與了病毒復(fù)制和翻譯的調(diào)控,但其確切機(jī)制仍不清楚。RNA復(fù)制子是能夠自我復(fù)制的病毒RNA,其結(jié)構(gòu)基因缺失或者為外源基因替代,但保留了基因組RNA復(fù)制所需的各種酶的基因及順式作用序列。利用復(fù)制子RNA可自主復(fù)制并穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的特點(diǎn),構(gòu)建含有報(bào)告基因的復(fù)制子系統(tǒng),并在登革病毒UTR中引入系列突變,可通過(guò)報(bào)告基因和實(shí)時(shí)RT-PCR等方法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)突變體復(fù)制和翻譯水平的改變,以闡明UTR中部分保守序列和元件在病毒復(fù)制、翻譯調(diào)控機(jī)制中的作用。目前,含有報(bào)告基因的復(fù)制子系統(tǒng)已成為病毒復(fù)制、翻譯調(diào)控機(jī)制研究的有力手段。為探討登革病毒基因組5′UTR部分保守的線性序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)在病毒復(fù)制和翻譯機(jī)制中的作用,本研究構(gòu)建了可在BHK-21細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)海腎螢光素酶(R.luc)報(bào)告基因的登革4型病毒亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1ank與prl-cmv載體大腸桿菌BD1528株和含有登革4型病毒814669株全長(zhǎng)感染性克隆的質(zhì)粒P4(GenBank登錄號(hào)AY648301)由美國(guó)NIAID/NIH傳染病實(shí)驗(yàn)室Whitehead博士惠贈(zèng);含有R.luc報(bào)告基因序列的pRL-CMV載體購(gòu)自Promega公司,登革4型多克隆鼠免疫腹水抗體由本室制備。大腸桿菌DH5α及傳代C6/36和BHK-21細(xì)胞由本室保存。1.1.2主要試劑DNA連接酶和克隆載體pMD-18-T購(gòu)自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB公司;SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(SP6RiboMAXTMlargescaleRNAproductionsystems)、帽子結(jié)構(gòu)類似物(RNAcapstructureanalog)和海腎螢光素酶檢測(cè)試劑盒(Renillaluciferaseassaysystem,100assays)購(gòu)自Promega公司;質(zhì)粒提取試劑盒(QIAfilterTMplasmidmaxikits)、RNA提取試劑盒(RNeasyue617minikit)、凝膠純化試劑盒QIAquickue617gelextractionkit)和PCR純化試劑盒(QIAquickue617PCRpurificationkit)購(gòu)自Qiagen公司;FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自中山公司。1.1.3擴(kuò)增報(bào)告基因的擴(kuò)增復(fù)制子構(gòu)建及鑒定所需的引物見(jiàn)表1,除擴(kuò)增報(bào)告基因的2對(duì)引物分別基于pRL-CMV和pEGFP-n1載體序列設(shè)計(jì)外,其他引物均基于p4載體序列設(shè)計(jì)。1.2方法1.2.1denrp擴(kuò)增片段的擴(kuò)增首先采用定點(diǎn)誘變PCR方法,以p4為模板,用F-△prME和R-△prME引物擴(kuò)增prM-E基因缺失片段,在缺失p4中第402～2344位核苷酸的同時(shí),將BsiWⅠ單酶切位點(diǎn)克隆入p4載體便于后續(xù)的克隆操作。擴(kuò)增片段和p4載體經(jīng)AscⅠ和XhoⅠ雙酶切后,以大腸桿菌BD1528為宿主菌將該擴(kuò)增片段克隆到p4載體,鑒定正確的克隆命名為DENRP。構(gòu)建策略見(jiàn)圖1。1.2.2den-r.luc2a-rp的構(gòu)建在成功構(gòu)建DENRP基礎(chǔ)上,先以質(zhì)粒pRL-CMV為模板,用F-Rluc和R-Rluc引物,擴(kuò)增R.luc報(bào)告基因和FMDV2A順式水解酶元件序列融合片段(R.luc2A)。所擴(kuò)增出的R.luc2A片段兩端均帶有BsiWⅠ酶切位點(diǎn)。經(jīng)BsiWⅠ酶切后,將該融合片段克隆到已構(gòu)建的DENRP載體,鑒定正確的克隆命名為DEN-R.luc2A-RP。同時(shí),采用重疊PCR方法,以p4為模板,用F1-△GDD/R1-△GDD和F2-△GDD/R2-△GDD引物擴(kuò)增缺失GDD基序片段,擴(kuò)增片段經(jīng)SacⅡ和MluⅠ雙酶切后,分別克隆至DENRP和DEN-R.luc2A-RP載體,鑒定正確的克隆命名為DEN-△GDD-RP和DEN-R.luc2A△GDD-RP。1.2.3utp、ctp、utp、utp、utp、utp、utp、utp、ppp的制備將上述復(fù)制子分別用Acc65Ⅰ線性化,回收定量后分別取1.5μg用SP6RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。采用30μl反應(yīng)體系,每管按順序加入10×SP6緩沖液6.0μl,NTP(25mmol/LATP、CTP、UTP和8.33mmol/LGTP)6.0μl,帽子結(jié)構(gòu)類似物[m7G(5′)ppp(5′)G,10mmol/L]1μl,線性化模板14.5μl,Sp6酶混合物2.5μl,37℃反應(yīng)3h后,加入DNase37℃孵育15min以去除模板DNA,純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并定量。取100μg轉(zhuǎn)錄體RNA利用RFGenePulseⅡ系統(tǒng)電穿孔轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,同時(shí)分別以感染性全長(zhǎng)cDNA克隆p4的轉(zhuǎn)錄體RNA為陽(yáng)性對(duì)照,以復(fù)制缺陷型復(fù)制子DEN-△GDD-RP和DEN-R.luc2A△GDD-RPRNA為陰性對(duì)照。1.2.421位denrp復(fù)制子的發(fā)現(xiàn)和鑒定1.2.4.實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)在用DENRP和DEN-R.luc2A-RP轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后72h,用TRIzol法提取總RNA,以F-D4RT和R-D4RT為引物,RT-PCR擴(kuò)增登革4型病毒E-NS1保守片段,檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中復(fù)制子特異RNA。同時(shí)以p4為陽(yáng)性對(duì)照,DEN-△GDD-RP和未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的DENRP總RNA為陰性對(duì)照。1.2.4.2.間接免疫絲光檢測(cè)對(duì)21個(gè)細(xì)胞的病毒特異性蛋白的發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)收集DENRP轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞制備抗原片,以登革4型病毒多克隆腹水抗體為一抗,間接免疫熒光檢測(cè)病毒特異性蛋白的表達(dá)。1.2.5細(xì)胞裂解液的測(cè)定DEN-R.luc2A-RP轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn),按照海腎螢光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū),收集24孔板中細(xì)胞裂解液,置于-70℃保存待檢。同時(shí)以轉(zhuǎn)染DEN-R.luc△GDD-RP的BHK-21細(xì)胞為陰性對(duì)照,在GloMax發(fā)光儀上檢測(cè)R.luc活性,反應(yīng)體系為每10μl細(xì)胞裂解液加入50μl反應(yīng)液,檢測(cè)參數(shù):2s預(yù)讀延遲,10s檢測(cè)時(shí)間。2結(jié)果2.1denrp關(guān)聯(lián)表達(dá)為探討登革4型病毒5′UTR和C基因保守序列和元件在病毒復(fù)制和翻譯機(jī)制中的作用,本研究首先采用定點(diǎn)誘變PCR方法擴(kuò)增缺失prM-E基因片段,再將其克隆到p4載體,構(gòu)建了prM-E結(jié)構(gòu)基因缺失的復(fù)制子DENRP。為進(jìn)一步觀察DENRP表達(dá)外源蛋白的能力,我們利用順式水解酶元件(cis-actinghydrolaseelement,CHYSEL)技術(shù)將R.luc插入到DENRP中缺失的結(jié)構(gòu)基因區(qū),構(gòu)建了含有R.luc報(bào)告基因的復(fù)制子DEN-R.luc2A-RP。同時(shí),通過(guò)刪除NS5中的GDD核心基序分別構(gòu)建復(fù)制缺陷型復(fù)制子DEN-△GDD-RP和DEN-R.luc2A△GDD-RP,作為相關(guān)的對(duì)照。以上構(gòu)建的復(fù)制子重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定,結(jié)果與預(yù)期的大小和序列相一致,部分酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。2.2denrp轉(zhuǎn)染與酶抑制劑的篩選為觀察所構(gòu)建復(fù)制子能否在轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞中自主復(fù)制并穩(wěn)定表達(dá)病毒蛋白,首先,在DENRP和DEN-R.luc2A-RP轉(zhuǎn)染后72h分別提取總RNA,采用RT-PCR方法擴(kuò)增登革4型病毒特異基因片段,檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中是否含有復(fù)制子特異的RNA。結(jié)果如圖3所示,以DENRP和DEN-R.luc2A-RP轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組及以全長(zhǎng)感染性克隆p4轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性對(duì)照組,均能夠擴(kuò)增出與預(yù)期大小相一致的條帶。而陰性對(duì)照組均未能擴(kuò)增出預(yù)期條帶,表明轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞中存在復(fù)制子特異的RNA。為進(jìn)一步鑒定復(fù)制子轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能否表達(dá)病毒特異蛋白,將DENRP轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后,于不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞制備抗原片,以登革4型病毒多克隆腹水抗體為一抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示,DENRP轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后第1天,在胞漿中即可觀察到綠色熒光,2～4d陽(yáng)性細(xì)胞比例增多,8d時(shí)陽(yáng)性信號(hào)減弱,陽(yáng)性細(xì)胞比例下降。表明所構(gòu)建的DENRP在BHK-21細(xì)胞中可表達(dá)病毒特異蛋白。2.3den-r.luc2a-rp轉(zhuǎn)染為觀察缺失prM-E基因的亞基因組復(fù)制子能否表達(dá)外源報(bào)告基因,我們構(gòu)建了含有R.luc報(bào)告基因的復(fù)制子DEN-R.luc2A-RP,通過(guò)檢測(cè)復(fù)制子轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)R.luc活性觀察復(fù)制子復(fù)制和翻譯水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DEN-R.luc2A-RP轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后6～10h出現(xiàn)了第1個(gè)信號(hào)峰,在24～96h形成第2個(gè)信號(hào)峰(圖5),之后緩慢下降,第1個(gè)信號(hào)峰的出現(xiàn)可能為轉(zhuǎn)染細(xì)胞后復(fù)制子RNA瞬時(shí)翻譯出的少量R.luc。由于R.luc的半衰期較短(約3.5h),在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中很快降解、失活,24h后陰性對(duì)照組的檢測(cè)值趨于零;而實(shí)驗(yàn)組復(fù)制子由于具有自主復(fù)制和翻譯能力,在24～96h由于R.luc表達(dá)量的快速增加和累加效應(yīng),出現(xiàn)了第2個(gè)更高的信號(hào)峰,并可維持在較高水平持續(xù)表達(dá)21d。上述結(jié)果表明,本研究獲得了可穩(wěn)定表達(dá)R.luc的復(fù)制子,并且在轉(zhuǎn)染后24～96h海腎螢光素酶活性可顯示出復(fù)制子復(fù)制和翻譯水平的變化。3復(fù)制子的構(gòu)建策略復(fù)制子是在相應(yīng)病毒基因組全長(zhǎng)感染性克隆的基礎(chǔ)上,其大部分結(jié)構(gòu)蛋白基因缺失或由外源基因替代,但保留了基因組RNA復(fù)制所需的各種酶的基因及順式作用序列而構(gòu)建成的病毒亞基因組。黃病毒復(fù)制子轉(zhuǎn)染細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞病變,在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定,目前已廣泛應(yīng)用于病毒復(fù)制和翻譯的分子機(jī)制、新型疫苗載體構(gòu)建、抗病毒藥物篩選等領(lǐng)域。利用復(fù)制子系統(tǒng)研究相應(yīng)黃病毒復(fù)制翻譯調(diào)控機(jī)制,具有顯著的優(yōu)勢(shì),表現(xiàn)在:①黃病毒復(fù)制子在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的時(shí)間長(zhǎng),可以在較長(zhǎng)的研究周期內(nèi)對(duì)復(fù)制子復(fù)制和翻譯水平進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè);②復(fù)制子轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不能組裝并釋放病毒顆粒,可排除病毒組裝帶來(lái)的干擾;③目前報(bào)告基因檢測(cè)、實(shí)時(shí)RT-PCR和IFA等手段可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)復(fù)制子復(fù)制和翻譯水平的改變。本研究構(gòu)建了登革病毒prM-E基因缺失或被海腎螢光素酶報(bào)告基因替代的病毒亞基因組復(fù)制子。在復(fù)制子構(gòu)建策略方面,一般認(rèn)為缺失C-prM-E或prM-E的復(fù)制子的功能無(wú)明顯不同,但本研究早期構(gòu)建的兩個(gè)缺失病毒的C-prM-E結(jié)構(gòu)基因復(fù)制子,分別保留C蛋白N端84和108個(gè)核苷酸,E蛋白保留C端81個(gè)核苷酸均未成功,而選擇缺失prM-E基因構(gòu)建復(fù)制子獲得了成功,表明C基因中除已報(bào)道的CS保守序列之外,可能還存在其他與病毒復(fù)制和翻譯調(diào)控機(jī)制相關(guān)的重要元件,其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。此外,本研究采用FMDV2A順式水解酶元件插入海腎螢光素酶報(bào)告基因,在構(gòu)建策略上優(yōu)于已報(bào)道的一些復(fù)制子。與IRES策略相比,FMDV2A策略具有以下優(yōu)點(diǎn):①操作簡(jiǎn)便,只需將去除終止密碼子的外源基因的C端與FMDV2A序列融合,設(shè)計(jì)長(zhǎng)鏈下游引物,并在上下游引物中分別引入合適的酶切位點(diǎn)即可方便地完成克隆操作;②FMDV2A長(zhǎng)度僅為60bp左右,遠(yuǎn)小于IRES的485bp,因而可插入外源基因的長(zhǎng)度增加;③FMDV2A調(diào)控的上下游基因共表達(dá)較均衡,而采用IRES策略,其上下游基因表達(dá)水平可相差10～100倍。在復(fù)制子功能鑒定方面,結(jié)果顯示本研究所構(gòu)建的登革prM-E基因缺失的復(fù)制子和含有海腎螢光素酶報(bào)告基因的復(fù)制子在BHK-21細(xì)胞中均獲得了穩(wěn)定的表達(dá),含有海腎螢光素酶報(bào)告基因復(fù)制子在轉(zhuǎn)染后24～96h可觀察到穩(wěn)定的螢光信號(hào),該檢測(cè)區(qū)間靈敏度較高。此外,海腎螢光素酶報(bào)告基因持續(xù)表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)于目前已報(bào)道的其他黃病毒復(fù)制子,分析其原因可能是:①本研究利