九孔鮑精子發(fā)生過程的透射電鏡觀察

動物精氣的形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)生過程是寄生蟲生物學的一項重要研究內(nèi)容，其結(jié)構(gòu)和運動方式與精子形成過程密切相關(guān)。因此,精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究歷來受到眾多學者的重視[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16]。在軟體動物中,有關(guān)雙殼類精子發(fā)生過程的研究國內(nèi)外已有不少報道,但對腹足類精子的研究卻相對較少,尤其是對重要經(jīng)濟種類鮑的研究,迄今為止國內(nèi)的報道多側(cè)重于皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究或比較。九孔鮑(Haliotisdiversicoloraquatilis)是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類,關(guān)于該種類的育苗、養(yǎng)殖及病害的研究已經(jīng)開展,但有關(guān)其精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)尚未見報道。本實驗對九孔鮑精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)變化進行觀察,以期能為腹足類的繁殖生物學及相關(guān)的基礎(chǔ)研究積累參考資料,同時能對九孔鮑人工苗種的生產(chǎn)實踐及多倍體育種技術(shù)起到一定的指導作用。12九孔鮑雄鮑于2004年10月~2005年3月取自福建惠安鮑養(yǎng)殖場。鮑個體質(zhì)量17~41g,殼長5.5~7.2cm?；铙w解剖,取出精巢切成1mm3左右的小塊,用2.5%戊二醛固定2h,0.1mol/L磷酸緩沖液沖洗,1%鋨酸后固定,酒精-丙酮系列脫水,環(huán)氧樹脂浸透、包埋,LKB-8800V超薄切片機切片,醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色,在JEM-100CXⅡ型透射電鏡下觀察并拍照。2結(jié)果2.1胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)和核型體積最大,緊貼精巢濾泡的基膜分布。胞體呈橢圓形,切面長徑6.4~7.7μm,短徑4.3~4.7μm。細胞質(zhì)較少,含有少量圓形線粒體,其嵴稀少而短;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稀少,呈小泡或小管狀;未見高爾基體等細胞器,但胞質(zhì)中有少許具膜的電子致密顆粒。細胞核大,位于細胞中央,大小為(4.8~5.0)μm×(3.3~3.5)μm,其形狀與胞體近似;核膜清晰,核周腔明顯;染色質(zhì)少,成絮狀附于核膜內(nèi)側(cè)或不均勻散布在核質(zhì)中(圖版Ⅰ-1)。2.2胞質(zhì)、高爾基體和核體由精原細胞生長轉(zhuǎn)化而來,細胞逐步脫離基膜。早期的初級精母細胞呈橢圓形,約6.1μm×3.8μm。進入減數(shù)分裂期的初級精母細胞大多呈卵圓形,約5.4μm×4.2μm。胞質(zhì)電子密度增高;線粒體數(shù)量增多,體積增大,嵴漸增多;有少量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體;高爾基體發(fā)育良好,呈數(shù)層扁平囊狀或環(huán)狀,其周圍胞質(zhì)中有較多的高爾基小泡;電子致密顆粒數(shù)量也增多;中心體結(jié)構(gòu)出現(xiàn),在一些切面上可見到2~3個橫切的“9+2”軸絲結(jié)構(gòu)。核形仍與胞體一致,大小為(4.5~4.8)μm×(4.0~3.2)μm;核周腔較大,核外膜局部明顯擴大為不規(guī)則的核膜泡;核內(nèi)染色質(zhì)增多,呈不規(guī)則團塊狀或條狀分布。有的核中可見同源染色體配對的聯(lián)會復合體(圖版Ⅰ-2、3、4、5)。2.3雙體細胞胞質(zhì)和結(jié)構(gòu)由初級精母細胞經(jīng)第一次成熟分裂(減數(shù)分裂)形成,這時期常見核分裂為二,而胞質(zhì)未分開的現(xiàn)象,形成雙核細胞。細胞卵圓形,約4.6μm×3.8μm。胞質(zhì)電子密度高;線粒體體積較大;電子致密顆粒逐漸集中于細胞的一端?！?+2”軸絲結(jié)構(gòu)明顯可見。胞核也近卵圓形,約3.3μm×2.8μm;局部核周腔和核膜泡清楚可見;核內(nèi)呈細顆粒狀的異染色質(zhì)進一步凝聚成大團塊,常染色質(zhì)區(qū)域變小(圖版Ⅰ-6)。2.4精細胞不同發(fā)育時期由次級精母細胞經(jīng)第二次成熟分裂產(chǎn)生,體積較之小,根據(jù)精細胞在變態(tài)期間胞質(zhì)與胞器的發(fā)育特征、核染色質(zhì)凝集程度及形態(tài)等的變化,將其分為5個時期。2.4.1胞質(zhì)及細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞體呈橢圓形,約3.8μm×2.2μm。可見到部分胞質(zhì)未完全分開的雙核細胞。在細胞核的一側(cè)開始出現(xiàn)前頂體囊的雛形,內(nèi)含電子密度中等的均勻絮狀物。胞質(zhì)中線粒體進一步融合,并逐漸移向細胞一端,數(shù)量較次級精母細胞開始減少。仍可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體散布。部分細胞質(zhì)開始往細胞的一側(cè)或核后遷移。在一些細胞內(nèi)可清楚觀察到軸絲的橫切與縱切面。核形仍與胞體一致,約2.4μm×1.8μm,呈較大顆粒狀的染色質(zhì)凝聚成更大的團塊,占據(jù)核內(nèi)大部分空間(圖版Ⅰ-7)。2.4.2軸絲及核型觀察,表現(xiàn)為雙軸面的下腔型電子致密度的測定,將所有小鼠亞胞體呈橢圓形,約3.4μm×2.1μm。前頂體囊遷移至核的前端并不斷增大,基本呈圓形。線粒體逐漸移至核的后端,融合為少數(shù)幾個,呈圓形或橢圓形,嵴增長。同時中心體也往核后端移至線粒體之間。兩個中心粒相互垂直排列,有一個橫切面為近圓形;另一個為短棒狀?？捎^察到軸絲結(jié)構(gòu)。細胞質(zhì)繼續(xù)往核后退縮。核多為橢圓形,約2.0μm×1.7μm;核周腔不明顯;染色質(zhì)顆粒逐漸變粗,并進一步濃縮呈粗團塊狀,電子致密度明顯增大,核內(nèi)電子透明區(qū)變小;核與頂體相接觸面的中央略內(nèi)凹(圖版Ⅰ-8、9,圖版Ⅱ-1)。2.4.3部分復雜,可能含有或欠缺基細胞形狀大小與Ⅱ期相似,約3.2μm×2.0μm。前頂體囊的內(nèi)含物繼續(xù)增多,電子致密度增加,這樣前頂體逐漸形成,但含有一些中空的膜泡。大部分胞質(zhì)已退至核后,只余一細柄與細胞相連,頂體和核周圍仍留有薄層胞質(zhì),其中可見少量高爾基膜囊。核近卵圓形,約1.8μm×1.6μm。粗顆粒狀的染色質(zhì)再濃縮,大部分融合成塊趨向均質(zhì)化,顆粒間隙已不明顯,但局部仍可見電子透明區(qū)。核前端中央逐漸內(nèi)凹,形成雛形核前窩,內(nèi)含密度較低的絮狀物質(zhì)(圖版Ⅱ-2)。2.4.4電子密度:中心粒、前窩形態(tài)逐漸與精子相似,細胞體積進一步縮小,約2.9μm×1.6μm。前頂體繼續(xù)發(fā)育,外觀呈圓錐形,內(nèi)部膜泡消失,內(nèi)含物大多呈均質(zhì);前頂體基部臨核面的中央內(nèi)凹,形成淺錐狀的亞頂體腔,內(nèi)含電子密度與頂體類似的物質(zhì)。細胞質(zhì)大量減少。精子中段形成,球狀線粒體堆積于核后,嵴長而密集。中心粒位于核后端的線粒體球之間。核形態(tài)趨向圓柱狀,大小為1.5μm×1.4μm;染色質(zhì)濃縮,大面積呈均質(zhì)化,電子密度進一步加大;染色質(zhì)空缺的透明區(qū)呈不規(guī)則小囊泡狀,或稱核泡,其內(nèi)有的可見少許膜囊或顆粒物質(zhì)。核前窩較明顯。核后端與線粒體相接觸的地方內(nèi)凹形成植入窩(圖版Ⅱ-3)。2.4.5頂體及核型內(nèi)染色質(zhì)與第Ⅳ期相比,本期主要變化是細胞核的延長。細胞大小為3.1μm×1.3μm。形態(tài)與精子基本相似。前頂體物質(zhì)密度增大,亞頂體腔進一步向前凹入,頂體形成。核延長呈長圓柱狀,為1.8μm×1.2μm。核內(nèi)染色質(zhì)高度濃縮,更均質(zhì)致密,有較少的核泡存在。核前窩凹陷加深,呈明顯“V”字形。最后,精細胞丟棄多余的細胞質(zhì)而演變?yōu)槌墒斓木?圖版Ⅱ-4)。九孔鮑成熟精子屬原始型精子,由頭部、中段和尾部3部分構(gòu)成(圖版Ⅱ-5、6)。3不同種類精母細胞的形態(tài)變化九孔鮑精子發(fā)生的過程類似于許多軟體動物雙殼類和其他腹足類,由精原細胞依次分化和形成初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞和精子。在這過程中,不同種類的精原細胞和精母細胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)變化差異不太大,種間差別較明顯的變化出現(xiàn)在精細胞變態(tài)為精子的一系列分化中。這些差異主要體現(xiàn)在頂體的形成、染色質(zhì)的濃縮、核形態(tài)的變化以及線粒體等胞器數(shù)量與行為的改變等幾個方面。3.1頂體顆粒在精母細胞中的體現(xiàn)軟體動物精子頂體的形成與高爾基體的活動密切相關(guān),也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的作用有一定聯(lián)系。在瓣鰓類和腹足類的許多精子中都觀察到高爾基體囊泡融合形成頂體的現(xiàn)象。其形成過程大同小異,大多是由高爾基體分泌的嗜鋨液泡或囊泡(也稱為前頂體顆粒)逐漸融合為前頂體囊,并遷移至核的前端,囊內(nèi)物質(zhì)由絮狀到均質(zhì),密度不斷增加;前頂體囊進一步發(fā)育為前頂體,最終,演變?yōu)椴煌瑒游锾赜械捻旙w形態(tài)。已有報道表明,由高爾基體分泌的前頂體顆粒早在精母細胞質(zhì)中就已存在。在大珠母貝(PinctadamaximaJameson)、太平洋牡蠣(Crassostreagigas)等的精母細胞和早期精細胞質(zhì)中,還觀察到一些形態(tài)有別于高爾基體液泡的高電子密度的球形顆粒,它們可在精細胞變態(tài)早期集中融合成前頂體泡故將這些顆粒也視為前頂體顆粒。上述兩類結(jié)構(gòu)也見于九孔鮑的精原細胞、精母細胞和早期精細胞質(zhì)中。據(jù)筆者觀察,后一類致密顆粒在精細胞開始分化時,較集中分布于細胞的一側(cè),而當細胞內(nèi)頂體初具雛形時,這些致密顆粒就難以見到,提示它們可能參與了頂體的形成。由此可見,頂體的成形雖然在精細胞變態(tài)為精子的過程中逐步顯現(xiàn),但頂體的前身物,早在精母細胞階段就已生成。Frank和Ernst曾指出,這是一種細胞產(chǎn)物早熟的表現(xiàn),它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—高爾基體系統(tǒng)的功能狀態(tài)有關(guān),在中、后期精細胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)消失,高爾基體失去了物質(zhì)來源,不可能再合成或分泌前頂體顆粒,因此,大量的前頂體顆粒在精母細胞中合成。筆者認同該觀點。就九孔鮑而言,在前頂體顆粒出現(xiàn)的精原細胞和精母細胞時期,可明顯觀察到高爾基體和少量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),說明這兩種胞器與頂體物質(zhì)的合成和分泌有關(guān),而在精細胞期已缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體亦少見,合成作用受阻,故精細胞時期已不可能再形成新的頂體顆粒,頂體的形成依賴于原有前頂體顆粒的融合與整合。3.2孔鮑精細胞的形態(tài)演變九孔鮑精細胞分化過程中,核的體積和形態(tài)都發(fā)生了較大的變化,經(jīng)歷了核內(nèi)染色質(zhì)逐漸濃縮、核體積逐漸縮小的過程。Walker認為,動物精子染色質(zhì)濃縮的形態(tài)可分為3類:顆粒狀、纖維狀和片狀。臺灣東風螺(Babyloniaformosae)、Chorusgiganteus的精細胞染色質(zhì)濃縮后為典型的片狀,Siphonaria的染色質(zhì)濃縮后為典型的纖維狀,而泥螺(Bullactaexarata)、中國圓田螺(Cipangopaludinachinensis)的染色質(zhì)濃縮則經(jīng)過顆?；屠w維化而至均質(zhì)。同屬腹足類的九孔鮑的染色質(zhì)變化則與此有較大的差別。九孔鮑在精細胞分化期間核內(nèi)的染色質(zhì)形態(tài)演變的順序為:絮狀小團塊→細顆粒團塊狀→粗顆粒團塊狀→粗顆粒均質(zhì)化→高電子密度的均質(zhì)。這種濃縮方式可視為顆粒化方式,與一些雙殼類的演變過程相似,表明染色質(zhì)的濃縮既有種屬的差異也有一定的演變規(guī)律。Maxwell研究分析,軟體動物的精子根據(jù)受精方式的不同可分為2種類型。第1種是原生型精子,一般屬于行體外受精的較低等的種類;第2種是修飾型(或稱改進型)精子,屬于行體內(nèi)受精的較高等的種類。原生型精子核內(nèi)染色質(zhì)的濃縮大多是顆粒狀,少數(shù)是纖維狀。九孔鮑屬原始腹足目,精卵結(jié)合于水中,與多數(shù)瓣鰓類同屬體外受精的種類,這或許是其染色質(zhì)濃縮方式更接近于瓣鰓類而有別于腹足類的原因之一。在精細胞分化過程中,伴隨著染色質(zhì)的聚集濃縮,九孔鮑精細胞核的形態(tài)也發(fā)生相應(yīng)的變化,核由橢圓形變?yōu)槁褕A型,再逐漸延長,最后變成與細胞長軸一致的長圓柱狀,這與青蛤(Cyclinasinensis)精細胞核的變化基本類似,但與其他軟體動物核的演變則有較大的差異。如菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum),其精細胞核由前期的橢圓形拉長成柱狀最后成錐形,太平洋牡蠣的核形態(tài)由圓形或橢圓形變成馬蹄形;臺灣東風螺的核一般由橢圓形成為扁平形,再呈長形;中國圓田螺核由圓形到馬蹄形、逐漸拉長,最后呈螺旋形。筆者認為,不同種類精細胞核形態(tài)變化的差異可能與其系統(tǒng)發(fā)育有密切關(guān)系,同時也與變態(tài)后精子的運動及受精方式有關(guān)。染色質(zhì)的濃縮和核體積的縮小,使精子的體積大大變小,這既有利于保存遺傳物質(zhì),也能增強精子的運動能力,從而保證受精作用的完成。3.3精母細胞時期的嘴唇形態(tài)變化線粒體是精子能量的供應(yīng)中心。隨著精子的發(fā)生、精細胞的變態(tài),其數(shù)量和體積也發(fā)生了一定的變化。總的來說,線粒體經(jīng)歷了數(shù)量由少到多、又到少,體積由小到大的變化過程,并在一定時期匯集于核后方并融合。本研究觀察表明,在精原細胞時期,九孔鮑的線粒體數(shù)目較少,散布于胞質(zhì)中,嵴稀少而短;到初級精母細胞時期,線粒體數(shù)量明顯增多,嵴也加長增多;至次級精母細胞時,線粒體逐漸移向細胞一端,并開始出現(xiàn)融合,體積由小