基于r-pcr的登革熱1-4型病毒保守區(qū)rna片段的制備

熱梨花是由熱病毒引起的急性皮疹。它在中國東南沿海地區(qū)廣泛流行。它容易在大規(guī)模動員和難民浪潮時發(fā)病率和繁榮。登革熱病毒還是重要的生物戰(zhàn)劑,有4種不同的血清型,即DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4。登革熱臨床癥狀與許多病毒性、細(xì)菌性和寄生蟲感染疾病在臨床上難以區(qū)別,以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的登革熱快速偵檢技術(shù)具有重大的軍事和社會意義。本研究克隆了登革熱1-4型病毒的部分型特異性基因序列,分別構(gòu)建至PGEM-T-easy載體,進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,獲得了定量拷貝數(shù)的含目的基因序列的RNA轉(zhuǎn)錄體,可為登革熱病毒的核酸快速檢測方法的建立和改進(jìn)提供準(zhǔn)確可靠的陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品。1材料和方法1.1材料表面1.1.1微生物檢測中心登革熱1-4型病毒培養(yǎng)液由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所微生物檢測中心提供。菌種XL10-gold購自美國Stratagene公司,pGEM-Teasy載體購自美國Promega公司。1.1.2酶及dna連接酶、dna制備及rt-pcr試劑盒病毒RNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司);PyrobestTaqDNA聚合酶、NdeI內(nèi)切酶及DNA連接酶、DNAMarkerDL2000、DNA純化及片段回收、抽提質(zhì)粒、RNA轉(zhuǎn)錄純化試劑盒為TaKaRa公司(中國大連)產(chǎn)品。SuperScriptIII一步法RT-PCR試劑盒(美國Invitrogen公司);RiboprobeSystem-T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)。1.2方法1.2.1den-3引物的設(shè)計根據(jù)DEN-1(GenBank登錄號AF513110)、DEN-2(GenBank登錄號AF489932)、DEN-3(GenBank登錄號AY099336)和DEN-4(GenBank登錄號AF326573)基因序列,設(shè)計擴(kuò)增各型登革熱病毒保守區(qū)基因的引物,其中Den-0為通用上游引物,DEN-P1～DEN-P4各為DEN-1至DEN-4的下游引物。由Takara(大連)公司合成(表1)。1.2.2病毒資源提取采用QIAGEN試劑盒并按說明書操作提取。1.2.3tinumtaq健康采用Invitrogen一步法試劑盒,反應(yīng)體系如下:2×ReactionMix25μl,PlatinumTaqMix2μl,RNA模板5μl,上下游引物(50pmol)各1μl,DEPC水補(bǔ)至50μl。反應(yīng)條件為:50℃反轉(zhuǎn)錄30min;94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火30s、68℃延伸100s,循環(huán)40次;最后再以68℃延伸5min。1.2.4別與pgem-t-tpge-制備法在T4DNA連接酶作用下,純化的PCR產(chǎn)物分別與PGEM-Teasy載體于20℃反應(yīng)1h后,4℃連接過夜。用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至XL10-gold細(xì)胞中。1.2.5質(zhì)粒的提取使用藍(lán)白斑試驗篩選重組質(zhì)粒,挑取白色菌落轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)液中,37℃,230r/min培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒DNA。以質(zhì)粒為模板,利用表1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢查插入片段的大小,根據(jù)目的片段大小來判定其陽性,送交上海捷瑞生物公司進(jìn)行雙向測序。1.2.6對優(yōu)質(zhì)粒載的線性處理和濃度測定質(zhì)粒用NdeⅠ內(nèi)切酶經(jīng)37℃消化2h,0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物,觀察線性化結(jié)果。1.2.7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的純化利用RiboprobeSystem-T7試劑盒,室溫配制20μl反應(yīng)體系:5×Buffer4μl,DTT(100mmol/L)2μl,RNasin(40U)1μl,rNTP(終濃度各為0.5mmol/L)5μl,線性化質(zhì)粒(0.3μg/μl)2μl,T7poly(18U)1μl,DEPCH2O5.5μl。反應(yīng)條件為37.0℃1h。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加Dnase(1U/μl)1.5μl繼續(xù)反應(yīng)20min除去DNA模板,用RNA轉(zhuǎn)錄純化試劑盒進(jìn)行純化并用NanoDropND1000分光光度計定量。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度可以換算為拷貝/μl?？截悢?shù)=濃度×阿伏加德羅常數(shù)/(1個堿基對的平均分子質(zhì)量×總長度),阿伏加德羅常數(shù)為6.02×1023。用DEPC水將其分別依次梯度稀釋。取各稀釋液作模板,進(jìn)行RT-PCR,引物和擴(kuò)增條件與前述步驟相同。2結(jié)果2.1en-4基因片段擴(kuò)增由圖1可知DEN-1、DEN-2、DEN-3、DEN-4基因擴(kuò)增片段大小與預(yù)期結(jié)果相符,分別約342bp、251bp、538bp和754bp,目的片段已成功克隆到PGEM-Teasy載體上。2.2den-1、den-3和den-4基因片段的同源性試驗登錄Genebank,將質(zhì)粒插入片段的測序結(jié)果進(jìn)行比對,結(jié)果顯示,克隆的DNA序列與DEN-1(登錄號AF513110)、DEN-2(登錄號AF489932)、DEN-3(登錄號AY099336)和DEN-4(登錄號AF326573)基因序列相應(yīng)片段的同源性100%,證實(shí)了堿基序列的正確性,能夠進(jìn)入下一步的體外轉(zhuǎn)錄等試驗。2.3質(zhì)量濃度比較體外轉(zhuǎn)錄的cRNA經(jīng)核酸蛋白測定儀測定,DEN1、DEN-2、DEN-3、DEN-4的質(zhì)量濃度分別為352.6ng/μl、384.2ng/μl、457.3ng/μl、368.7ng/μl,D260nm/D280nm分別為1.92、1.87、2.01、1.96。根據(jù)拷貝數(shù)計算公式,分別將其梯度稀釋為5.0×1011～5.0×102拷貝/μl。2.4pcr電泳結(jié)果以梯度稀釋的體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物作模板,作RT-PCR。其中DEN-1體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RT-PCR電泳結(jié)果見圖2。由圖可知,PCR產(chǎn)物為342bp,且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量濃度5.0×102拷貝/μl時,仍出現(xiàn)清晰目的條帶。DEN-2、DEN-3、DEN-4基因的體外轉(zhuǎn)錄鑒定結(jié)果與DEN-1相同,在質(zhì)量濃度為5.0×102拷貝/μl時均出現(xiàn)清晰目的條帶。3rt-pcr擴(kuò)增效果的評價登革熱廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū),每年病例數(shù)百萬計,成為分布最廣、發(fā)病最多、危害較大的蟲媒病毒性疾病,在我國廣東、海南、福建等沿海省份時有局部暴發(fā)疫情,嚴(yán)重威脅軍民健康。以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的登革熱快速偵檢技術(shù)的建立,對及時進(jìn)行臨床診斷與救治、流行病學(xué)調(diào)查和生物戰(zhàn)劑的快速檢測,最終控制其傳播流行具有重要意義。而這些基因診斷方法的建立和優(yōu)化需要相應(yīng)的RNA片段作為陽性對照,但要獲得登革熱病毒RNA有高感染風(fēng)險。因此,本研究采用構(gòu)建含有T7啟動子的重組質(zhì)粒,直接用T7RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得RNA片段,并準(zhǔn)確定量,可作為登革熱病毒的核酸擴(kuò)增快速偵檢技術(shù)方法的陽性對照,無生物安全隱患。同時也避免了以往研制的商品化試劑盒中質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不能很好地對樣品處理及逆轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行有效控制的問題。本實(shí)驗體外轉(zhuǎn)錄獲得的DEN-1、DEN-2、DEN-3、DEN-4RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物陽性標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)量濃度分別為352.6ng/μl、384.2ng/μl、457.3ng/μl和368.7ng/μl,用DEPC水進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋,換算成拷貝數(shù)為5.0×1011～5.0×102拷貝/μl。按照上述優(yōu)化好的RT-PCR反應(yīng)體系和程序分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均出現(xiàn)目的條帶,結(jié)果證實(shí)RT-PCR至少可以檢出5.0×102拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品。本研究成功克隆了登革熱1-4型病毒的部分靶基因,并構(gòu)建了相應(yīng)的重組質(zhì)粒,進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得了陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行了準(zhǔn)確定量,為進(jìn)一步開展登革熱病毒的功能、結(jié)構(gòu)等研究奠