次聲作用后大鼠下丘腦室旁核小膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞的變化

第二次聲采集是由物體（材料）的機械振動引起的，頻率為0.0001.20hz。次聲廣泛存在于我們的環(huán)境中,這些低頻噪聲除污染環(huán)境并危害著人們的健康。次聲噪音和次聲武器作用于人體后可產(chǎn)生多種危害,可以引起機體行為學、形態(tài)學、蛋白、分子等多方面的改變。小膠質(zhì)細胞(microglia,MI)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐的免疫細胞,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷、卒中、炎性以及神經(jīng)變性性疾病的發(fā)病過程。因此,研究次聲作用后MI的變化對了解次聲性腦損害機制和腦保護的研究具有十分重要的理論和實用價值。本文對大鼠下丘腦室旁核(paraventricularnucleus,PA)進行OX42和抗GFAP免疫組織化學熒光雙標記染色。對次聲作用后不同時間點MI變化情況及其與星形膠質(zhì)細胞的關(guān)系進行了觀察。材料和方法一、大鼠次聲作用成年雄性SD大鼠20只,由本校實驗動物中心提供,體重250～300g。隨機分為次聲作用1d組,7d組,14d組和對照組,每組5只大鼠。小鼠抗OX42單克隆體(1:800,Chemicon公司),兔抗GFAP單克隆抗體(1:1500,Chemicon公司)。二、方法1.電激勵式次聲壓力顱內(nèi)壓力次聲作用次聲作用組大鼠每天置于本校研制的電激勵式次聲壓力艙內(nèi)給予16Hz130dB次聲每天2h,對照組動物每天放入次聲艙內(nèi)無次聲作用。2.動物分組、大鼠蔗糖沉底將大鼠暴露于次聲環(huán)境后,麻醉大鼠(戊巴比妥鈉40mg/kg,腹腔注射),用過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛液(periodate-lysine-paraform-alde-hydefixative,PLP)固定液灌注固定大鼠,30%蔗糖沉底。取前腦,恒冷切片機冠狀切片,片厚30μm,切片分套,置于60%甘油中-20℃存放。3.小鼠血清學檢測取一套切片在0.01mol/L磷酸鉀鹽緩沖液(phosphate-bufferedsaline,PBS)中漂洗3次,每次10min。然后入含有OX-42(1:800,Chemicon公司)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillarylacidicprotein,GFAP)(1:1500,Chemicon公司)兩種抗體的稀釋液,孵育48h(4℃);再經(jīng)德克薩斯紅(Texasred)標記的羊抗兔(1:500,Sigma)和異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)標記的兔抗小鼠IgG(1:500,Sigma)抗血清室溫孵育2h(避光),甘油PBS封片,顯微鏡下觀察。每步驟后均用0.01mol/LPBS充分洗滌(漂洗3次,每次10min)。陰性對照以0.01mol/LPBS代替抗相應抗體液。4.圖像分析方法光鏡下(Bx-51,Olympus,Japan)觀察下丘腦切片并應用軟件(LeicaQ570c圖像分析系統(tǒng),Germany)采集圖像;應用Image-ProPlus軟件分析系統(tǒng)統(tǒng)計數(shù)據(jù):在相同電壓下測量大鼠下丘腦一個視野一定區(qū)域內(nèi)OX42、GFAP陽性細胞光密度值(×200);實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,應用GraphPadPrism軟件,用單因素方差分析法(One-wayANOVA)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果一、mi被激活的原因由圖1A2-D2可見對照組大鼠PA區(qū)的0X42陽性細胞數(shù)量較少(光密度值為64.54±14.03),為靜息狀態(tài),表現(xiàn)為胞體小、核呈現(xiàn)扁長或多角形,突起長;次聲作用后1dMI被激活:表現(xiàn)為MI數(shù)量顯著增多(光密度值為97.24±10.03,P<0.01);0X42陽性細胞深染,胞體變大變圓,突起變短、變粗長。次聲連續(xù)作用7d后,大多數(shù)0X42陽性的MI還是表現(xiàn)為活化狀態(tài),但細胞數(shù)量與1d組相比明顯降低(光密度值為82.43±8.87,P<0.05),但此數(shù)值仍高于對照組。而次聲連續(xù)作用14d后,0X42陽性的活化MI數(shù)量恢復到正常水平(光密度值為69.81±11.49),但活化的MI的比例仍占多數(shù)。二、gfap光密度值的測定由圖1A1-D1可見隨著次聲作用天數(shù)的增加大鼠下丘腦室旁核GFAP陽性細胞開始逐漸增多、密集且胞體變大,突起變短、增多、變粗變長,呈活化狀態(tài)(對照組GFAP光密度值為40.19±1.85,次聲作用后1d,7d,41d的光密度值分別為42.99±3.10,56.90±2.64,69.72±3.86,P<0.01)。GFAP陽性細胞在第7d時數(shù)量開始增加,并且14d組最為密集,活化最明顯。三、mi與星形膠質(zhì)細胞的聯(lián)系多表現(xiàn)為第一由圖1A3-D3可見正常大鼠MI分布與星形膠質(zhì)細胞無特殊關(guān)系,而隨著次聲作用時間的延長,MI與星形膠質(zhì)細胞的關(guān)系逐漸密切,大多成對出現(xiàn),此外還可發(fā)現(xiàn)兩細胞間出現(xiàn)橙黃色的雙標記突起,且有這種聯(lián)系的突起數(shù),隨著次聲作用天數(shù)的增加逐漸增多。mi通過實驗活動誘導mi作次聲被公認為體外環(huán)境應激源之一,機體的生理—心理反應即應激是機體對次聲產(chǎn)生反應的重要方面。強度次聲作用后可破壞人的適應能力,出現(xiàn)頭痛、惡心、疲倦、注意力不能集中等癥狀。失控的活化MI可能通過釋放許多不同的物質(zhì)比如炎性細胞因子,谷氨酸及超氧化物等直接對中樞神經(jīng)造成損傷?；c此,近年來MI在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用越來越受到重視。目前有關(guān)次聲的研究主要集中在氧化應激、細胞內(nèi)鈣離子超載、過氧化反應等方面,而有關(guān)MI與次聲的關(guān)系方面還沒有人報道。次聲可損害腦的邊緣葉、下丘腦等皮層下結(jié)構(gòu),可以引起機體行為學、形態(tài)學、蛋白、分子等多方面的改變,出現(xiàn)間腦-下丘腦綜合征。下丘腦是植物神經(jīng)系統(tǒng)的高級調(diào)控機關(guān),可通過垂體調(diào)節(jié)重要的激素系統(tǒng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌器官與植物神經(jīng)系統(tǒng)的相互作用。既往的研究指出次聲作用后下丘腦室旁核CRH表達有明顯的增加;下丘腦室旁核小細胞部細胞分泌的促腎上腺素釋放激素(corticotrophin-regulatingfactor,CRF)是下丘腦-垂體-腎上腺軸的重要因子。皮質(zhì)類固醇受體不僅僅表達與神經(jīng)元還表達在MI上,外源性CRH可使MI活化,并增加其炎性細胞因子的釋放。應激反應所造成的外周免疫反應可以誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前炎性免疫應答。MI可以經(jīng)突觸活化,這意味著它可能是應激的應答者。Nair和Bonneau最近報道慢性應激可以誘導MI活化和增殖,這一效應被糖皮質(zhì)激素和N-甲基-D-天(門)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體介導。Frank等報道電刺激24h后可以使MI活化的表面標志物主要組織相容性(抗原)復合物II(majorhistocompabilitycomplexII,MHCII)表達上調(diào),而星形膠質(zhì)細胞的標志物GFAP沒有變化。本實驗結(jié)果同樣提示MI的變化早于星形膠質(zhì)細胞的變化。以往的研究表明次聲作用后對下丘腦產(chǎn)生的其他影響如:細胞內(nèi)鈣離子超載、脂質(zhì)過氧化反應等也是在第7d時才開始改變,在次聲作用28d后中樞神經(jīng)系統(tǒng)對次聲損傷開始適應,大多數(shù)損傷指標恢復正常。MI激活后可以分泌許多細胞因子,誘導星形膠質(zhì)細胞增殖,少突膠質(zhì)細胞的分化以及血管發(fā)生等。由此可以看出次聲作用可以引起MI的變化,并且這種變化早于腦中其他細胞、分子的變化,這些細胞、分子的后反應可能部分是由于MI活化而釋放的一系列物質(zhì)的結(jié)果。眾所周知縫隙連接可以存在與相同類型細胞間比如:神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞;它們也可能存在與不同細胞類型間比如:神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞,神經(jīng)元與MI,MI與星形膠質(zhì)細胞間;有報道指出在小鼠大腦皮層內(nèi)MI的突觸與星形膠質(zhì)細胞的突觸、神經(jīng)元胞體、血管直接接觸。我們的研究發(fā)現(xiàn)次聲作用后大鼠下丘腦室旁核MI早期就開始活化,活化的MI主要分布于星形膠質(zhì)細胞周圍,且隨次聲作用時間的增加兩者間關(guān)系越來越密切,可以看出兩者間的雙標記突起越來越多,這種雙標記突起可能為兩者間形成縫隙連接。由此可以看出一定強度的次聲作用于人體后,可以對下丘腦室旁核造成