RNA甲基化與MeRIP-Seq測序技術(shù)

——甲基化DNA免疫共沉淀技術(shù)（MeDIP）、RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀技術(shù)（RIP）和RNA測序技術(shù)（RNA-seq）1RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性目錄一、探究與技術(shù)—研究歷程

（方法：使用關(guān)鍵詞“MeRIP”在NCBI上檢索到21篇相關(guān)文獻(xiàn)，形成綜述）3~8頁二、探究與技術(shù)—服務(wù)歷程

（方法：找到并查看提供此類服務(wù)的三家公司，發(fā)布服務(wù)的思路與消息）9~9頁三、研究與技術(shù)服務(wù)意義

（方法：綜合學(xué)術(shù)界發(fā)展勢態(tài)與技術(shù)服務(wù)發(fā)展勢態(tài)）10~10頁四、實(shí)驗(yàn)原理與本質(zhì)—Peak峰出現(xiàn)的原理

（方法：綜合NCBI上檢索到21篇文獻(xiàn)中的相關(guān)技術(shù)言論，著重解釋了實(shí)驗(yàn)原理與Peak峰出現(xiàn)的原理）11~12頁五、MeRIP-Seq測序?qū)嶒?yàn)簡易流程

（方法：深入淺出，用簡單的流程描述本技術(shù)）13~13頁六、北京基因組研究所流程與上海晶能生物流程（方法：找出關(guān)鍵技術(shù)文獻(xiàn)兩篇，詳細(xì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)路線）14~14頁提示，晶能生物在NCBI上有署名文獻(xiàn)七、MeRIP-Seq可行性報(bào)告與方案

15~17頁（方法：綜合MeDIP-Seq技術(shù)、RNA-Seq技術(shù)、m6A成熟抗體技術(shù)、mRNA成熟片段化技術(shù)提出“定量化”的執(zhí)行方案）八、采購試劑方案（方法：找出必要的2~4類試劑的采購供應(yīng)情況，均有代理商?。?8~18頁九、目前我國甲基化診斷產(chǎn)品注冊(cè)情況20~21頁（方法：在CFNA官方網(wǎng)站上已經(jīng)可以檢索到一例甲基化診斷試劑盒（PCR熒光探針法））2RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性

探究與技術(shù)MeRIP-Seq測序技術(shù)甲基化轉(zhuǎn)錄組RNA免疫共沉淀—高通量測序技術(shù)（MethylatedRNAImmunoprecipitationSequencing）

研究歷程分析方法：以關(guān)鍵詞“MeRIP”在NCBI上檢索文獻(xiàn)，共檢索到21篇文獻(xiàn)，按照時(shí)間順序查看文獻(xiàn)研究流程。1、2012年，康奈爾大學(xué)威爾醫(yī)學(xué)院提出MeRIP-Seq測序技術(shù)，就是指全轉(zhuǎn)錄組m6A定位的方法，即結(jié)合m6A特異性甲基化RNA免疫沉淀技術(shù)與新一代測序技術(shù)的結(jié)合（MeRIPSeq）。一、抗體的制備方法：anti-m6A抗體（來自文獻(xiàn)1987/2011/1977）二、建庫樣本類型：m6A在RNA定位于成熟的mRNA中，而不在PolyA尾部。三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析類型：Peak檢測峰的分布、Peak（檢測峰）統(tǒng)計(jì)分析與可視化、檢測峰中motif基序統(tǒng)計(jì)分析與可視化等。

提示：大量的m6A存在于細(xì)胞0.1–0.4%的總RNA腺苷殘基中，這表明這種修飾在轉(zhuǎn)錄組可能普遍存在。雖然m6A發(fā)現(xiàn)于許多年前，但是在基于m6A修飾mRNA引發(fā)的病患研究進(jìn)展緩慢。這在很大程度上是因?yàn)槿狈捎玫臋z測m6A的方法。因?yàn)榧谆佘詹粫?huì)改變其與胸腺嘧啶或尿嘧啶堿基結(jié)合的能力，m6A也不適用于標(biāo)準(zhǔn)的雜交或測序的檢測技術(shù)。

Cell.2012Jun22;149(7):1635-46.

3RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性2、2013年，中國科學(xué)院北京基因組研究所提出MeRIP-Seq改進(jìn)測序數(shù)據(jù)分析方法，就是指有效識(shí)別m6A修飾區(qū)域，并且統(tǒng)計(jì)分析和可視化測序數(shù)據(jù)。一、m6A峰在RNA不同區(qū)域分布的餅狀圖。二、m6A峰在RNA三類區(qū)域分布的百分率。三、m6A位點(diǎn)在特定轉(zhuǎn)錄本序列中的位置。

提示：文章中的分析方法MeRIP—PF可以實(shí)現(xiàn)了m6A信號(hào)或檢測峰的基因注釋，結(jié)果可以Excel和圖形格式輸出，有利于研究的進(jìn)一步開展。MeRIP—PF在Perl上完成，并且可從的免費(fèi)獲得。GenomicsProteomicsBioinformatics.2013Feb;11(1):72-5.4RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性3、2014年，西安交大利物浦大學(xué)生物科學(xué)系和西北工業(yè)大學(xué)開發(fā)RNA甲基化差異分析軟件包，就是指MeRIP-Seq測序數(shù)據(jù)分析軟件、原序列比對(duì)、RNA甲基化位點(diǎn)檢測、模體序列發(fā)現(xiàn)、RNA差異甲基化分析和功能分析。

2015年，西安交大利物浦大學(xué)生物科學(xué)系和西北工業(yè)大學(xué)在中國《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展》上發(fā)表名為《高通量RNA甲基化測序數(shù)據(jù)處理與分析研究進(jìn)展》的綜述文章。

提示：MeRIP-Seq測序技術(shù)還處于非常早期發(fā)展階段。文章討論了每個(gè)處理步驟背后的基本原理，以及具體實(shí)踐方法和可能的替代策略，并且exomepeakR/Bioconductor包是免費(fèi)提供，參見。Methods.2014Oct1;69(3):274-81.4、2014年，中國科學(xué)院北京基因組研究所研究了模式植物水稻全轉(zhuǎn)錄組RNA甲基化（愈傷組織Vs葉片）特點(diǎn)，就是指甲基化位點(diǎn)的分布特點(diǎn)、甲基化與表達(dá)量的關(guān)系、組織表達(dá)差異統(tǒng)計(jì)分析、甲基化富集GO功能差異分析。一、m6A峰在RNA三類區(qū)域分布的百分率。二、m6A位點(diǎn)在特定轉(zhuǎn)錄本序列中的位置。三、甲基化富集GO功能差異分析。RNABiol.2014Sep;11(9):1180–1188.5RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性(B)GOanalysisofcommonlymethylatedgenes(CM)andselectivelymethylatedgenesincallus(CS)andleaf(LS).

GO功能分析常見甲基化基因（CM）與選擇性甲基化基因在愈傷組織（CS）和葉片（LS）中的表達(dá)可視化圖。RNABiol.2014;11(9):1180-8.提示：可以說自此（2015年初）后，MeRIP-Seq測序技術(shù)發(fā)展模式基本確定，就是采用MeRIP-Seq測序技術(shù)研究模式物種，然后在整體水平上做mRNA中m6A位點(diǎn)的分布和特定位點(diǎn)做表達(dá)量、甲基化位點(diǎn)的確定，還有組織差異和條件差異的GO功能分析等。6RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性

5、2015年，西北工業(yè)大學(xué)繼續(xù)討論和研究RNA甲基化和去甲基化酶，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行薈萃分析，從系統(tǒng)水平尋找共同的甲基化調(diào)節(jié)方式。MolBiosyst.2015Jan;11(1):262-74.6、2015年，西安交通大學(xué)利物浦和中國礦業(yè)大學(xué)繼續(xù)討論和研究開展RNA甲基化數(shù)據(jù)庫的建設(shè)，提示RNA甲基化領(lǐng)域的發(fā)展?jié)摿?。NucleicAcidsRes.2015Jan;43(Databaseissue):D197-203.7、2015、2017年，芝加哥大學(xué)化學(xué)系、生物化學(xué)與分子生物學(xué)系從RNA交聯(lián)和免疫共沉淀和MeRIP技術(shù)出發(fā)開展研究m6A的分子開關(guān)作用，提示作者繪制了大量相關(guān)性和對(duì)比類的圖形；2017研究識(shí)別m6A位點(diǎn)的蛋白。Nature.2015Feb26;518(7540):560-4.Methods.2017Aug15;126:105-111.8、2015年，西安交大利物浦大學(xué)生物科學(xué)系繼續(xù)討論和研究開發(fā)了基于HMM隱馬爾可夫模型的峰識(shí)別尋峰算法，意在尋找更好的尋峰算法。BMCGenomics.2015;16Suppl4:S2.9、2015、2016、2016、2017.8年，西北工業(yè)大學(xué)、西安交大利物浦大學(xué)、麻省理工學(xué)院、揚(yáng)州大學(xué)繼續(xù)討論和研究基于HMM隱馬爾可夫模型的差異甲基化區(qū)域分辨、病例-對(duì)照差異甲基化問題、基因注釋問題、精確預(yù)測mRNA甲基化位置；差異甲基化分析。BiomedResInt.2015;2015:852070.AnalBiochem.2016Apr15;499:15-23.BiomedResInt.2016;2016:8367534.Bioinformatics.2016Jun15;32(12):i378-i385.BMCGenomics.2016Aug22;17Suppl7:520.BMCBioinformatics.2017Aug31;18(1):387.

10、2017年，奧地利因斯布魯克醫(yī)科大學(xué)從另一個(gè)甲基化位點(diǎn)m5C角度研究RNA甲基化并且對(duì)比和m6A的關(guān)系。技術(shù)路線：按照重亞硫酸鹽測序（BS-Seq）的思路進(jìn)行，可以實(shí)現(xiàn)C到U的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組測序分析。GenomeBiol.2017Jan5;18(1):1.11、2017年，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)和晶能生物采用公司服務(wù)的方式研究了豬肌肉和脂肪組織m6A甲基化譜，完成了多種數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)：整體水平上做mRNA中m6A位點(diǎn)的分布和特定位點(diǎn)做表達(dá)量、甲基化位點(diǎn)的確定，還有組織差異和條件差異的GO功能分析等。BMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.7RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性

12、2017年8月，賓夕法尼亞大學(xué)細(xì)胞和分子生物學(xué)研究生院發(fā)表綜述論文《鑒賞表觀轉(zhuǎn)錄組epitranscriptome：新技術(shù)和新觀點(diǎn)》。Enzymes.2017;41:269-298.Epub2017Apr14.

13、2017年9月，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所研究了斑馬魚造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞m6A甲基化譜，又一次完成MeRIP-Seq技術(shù)的應(yīng)用。Nature.2017Sep14;549(7671):273-276.Epub2017Sep6.14、2018年1月，中山大學(xué)腫瘤防治中心、中國南方地區(qū)腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和國防科技大學(xué)提出研究m6A甲基化RNA位點(diǎn)變異的重要意義。提出：最近，N6-甲基腺嘌呤（m6A）已成為研究的熱點(diǎn)，在許多基出生物學(xué)過程和各類疾病中起到關(guān)鍵作用。NucleicAcidsRes.2018Jan4;46(D1):D139-D145.

15、2017年12月，香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院肝臟研究和病理區(qū)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室使用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，m6A-Seq（MeRIP-Seq）和MeRIPqRT-PCR的方法共同檢測目標(biāo)基因的m6A修飾；提出：近年來，RNA的多樣性和可逆性化學(xué)修飾成為一種新的表觀遺傳調(diào)控。Hepatology.2017Nov24.拿到的兩篇文獻(xiàn)——

1、2014年，芝加哥大學(xué)化學(xué)系和生物物理學(xué)研究所發(fā)表綜述文章《由可逆m6A甲基化RNA介導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制》，文中這種“RNA的化學(xué)標(biāo)記”調(diào)劑機(jī)制中的相關(guān)蛋白被描述為“橡皮擦”、“閱讀者”和“書寫者”，以及mRNA的動(dòng)態(tài)特征；提示：m6A甲基化RNA研究的重要意義。NatRevGenet.2014May;15(5):293-306.

2、2016年，耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系和耶魯干細(xì)胞中心研究了哺乳動(dòng)物小鼠胚胎干細(xì)胞中m6A的DNA甲基化譜。提示：研究組研究的主題是m6A的DNA甲基化譜，對(duì)m6A的RNA甲基化的研究思路有指導(dǎo)作用。Nature.2016Apr21;532(7599):329-33.8RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性

服務(wù)歷程三家企業(yè)2016~2017年相繼推出RNA甲基化服務(wù)（MeRIP-Seq服務(wù)）—廣州表觀生物（成立于2016年11月）、廣州銳博生物（成立于2004年“千人計(jì)劃”專家張必良博士）和武漢生命之美（成立于2010年7月）。上海晶能生物合作過相關(guān)服務(wù)2017年4月。1、廣州表觀生物

一、2017年9月，RNA甲基化（m6A）免疫共沉淀高通量測序（MeRIP-seq）服務(wù)方案。含基本分析內(nèi)容：原始數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)、過濾后數(shù)據(jù)質(zhì)量QC圖、測序序列與參考基因組比對(duì)、基因組覆蓋度分布。PeakCalling分析、Peak可視化、Peak統(tǒng)計(jì)分析、m6A的基本特征（peak在基因元件的分布、reads在基因元件的分布、Peak關(guān)聯(lián)基因的特征）、差異peak分析、motif分析。沒有GO功能分析。二、樣本要求—物種信息（僅限人、大小鼠物種，其他物種需評(píng)估）；實(shí)驗(yàn)樣本：細(xì)胞、組織、提取后的總RNA（限定有參基因組物種）三、方案思路：實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置：細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)組VS對(duì)照組，建議3:3；組織模型正常組VS疾病組，建議5:5；組內(nèi)對(duì)照：IP組VSinput組（input組主要用于比較鑒定IP組的抗體特異性結(jié)合，是必備的組分）。測序模式：PE100/150，測序數(shù)據(jù)：3-6G。2、武漢生命之美

一、方案思路：meRIP建庫流程—meRIP分析流程（質(zhì)量分析、peak分析、motif分析、GO功能分析、KEGG通路分析）3、廣州銳博生物

一、服務(wù)特點(diǎn):1.甲基化篩選范圍廣，全轉(zhuǎn)錄組范圍篩查，通量高；2.豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，已與多家單位合作；3.項(xiàng)目周期快：30工作日完成；4.分析內(nèi)容全面，更有定制化與其他組學(xué)數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析。二、推薦測序模式：HiSeq2500、SE5020Mcleanreads三、方案思路：meRIP建庫流程—meRIP分析流程（質(zhì)量分析、peak分析、motif分析、GO功能分析、KEGG通路分析）

提示：MeRIP-seq基本可行，實(shí)驗(yàn)流程問題不大，服務(wù)的關(guān)鍵在于后期分析所能提供的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和分析方法。值得一提的是，這三家公司沒有學(xué)術(shù)上的產(chǎn)出，只是在網(wǎng)頁上掛出相關(guān)的技術(shù)原理和服務(wù)流程（坐待時(shí)機(jī)）。然而，上海晶能生物沒有掛出RNA甲基化服務(wù)，卻幫助完成高校發(fā)表高水平學(xué)術(shù)論著。9RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性研究與服務(wù)意義1、表達(dá)水平甲基化與測序檢測技術(shù)的一次結(jié)合。2、但凡相關(guān)文章的發(fā)表，都是有高水平期刊雜志收錄和承當(dāng)；樣本處理與數(shù)據(jù)分析合理，發(fā)在Nature和Cell上都不困難，2018年仍然會(huì)延續(xù)這種情況。3、投入本領(lǐng)域和技術(shù)研究與服務(wù)的知名高校和單位，逐步緩慢增加，他們的評(píng)價(jià)也是積極的。4、在我國的期刊雜志上，尚未出現(xiàn)相關(guān)技術(shù)的文獻(xiàn)；提示技術(shù)有觀望者，但能夠執(zhí)行的機(jī)構(gòu)和單位尚未涌現(xiàn)。5、在上海尚無一家機(jī)構(gòu)公開提供RNA甲基化相關(guān)服務(wù)，學(xué)術(shù)研究也處于無從展開的階段。5、預(yù)測未來五年，甲基化研究可能迎來充足的研究動(dòng)力和廣闊應(yīng)用潛力；學(xué)者們的相關(guān)文獻(xiàn)也會(huì)從國內(nèi)逐步轉(zhuǎn)向國內(nèi)。近兩年，會(huì)有大量相關(guān)學(xué)術(shù)研究成果發(fā)表在外文高水平期刊上。10RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性實(shí)驗(yàn)原理與本質(zhì)（intrinsicquality）MeRIP-Seq測序文庫的制備差異點(diǎn)——一、去除rRNA首先從樣本細(xì)胞或組織中分離出RNA，考慮到總RNA中含有大量的rRNA序列，需要結(jié)合不同的方法除去其中的rRNA。含有PolyA尾的可以利用這一特點(diǎn)分離mRNA。不含的可以用相應(yīng)試劑盒提取。二、平行測序內(nèi)對(duì)照Control樣本提取的mRNA隨機(jī)打斷后，需要分成兩組。一組對(duì)甲基化修飾片段（IP片段，免疫沉淀片段）進(jìn)行測序，一組對(duì)轉(zhuǎn)錄本片段（Control片段/背景片段，表達(dá)量片段）進(jìn)行測序。不同與免疫芯片方法的原因是，任何樣本的mRNA表達(dá)量和表達(dá)譜都存在差異（差異表達(dá)）?？傊?，RNA甲基化不僅可以引起甲基化的發(fā)生，也可以引起RNA總表達(dá)量的改變。西交利物浦，高通量RNA甲基化測序數(shù)據(jù)處理與分析研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2015(10):891-899.侯建永.MeDIP-seq檢測游離SiO2所致肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的DNA甲基化[D].鄭州大學(xué),2016.11RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性Peak峰出現(xiàn)的原理與本質(zhì)（intrinsicquality）Cell.2012Jun22;149(7):1635-46.一、檢測的差異性IP片段樣本——實(shí)現(xiàn)了對(duì)甲基化reads和甲基化位點(diǎn)（打斷的隨機(jī)性和廣泛性）的富集與測序。Control片段樣本——實(shí)現(xiàn)了對(duì)正常當(dāng)前表達(dá)的所有reads和位點(diǎn)的一般性檢測與測序（非富集狀態(tài)）。二、歸一化比較與峰產(chǎn)生1、歸一化由于手動(dòng)上樣不可能實(shí)現(xiàn)，IP樣本和Control樣本各自所上樣本量一致，但是通過內(nèi)部內(nèi)參基因的歸一化處理，所有數(shù)據(jù)變得可以比較。或者說，可以化作單個(gè)細(xì)胞某基因的表達(dá)數(shù)量（Control歸一化數(shù)據(jù)）和單個(gè)細(xì)胞某基因的甲基化數(shù)量（IP歸一化數(shù)據(jù)）。2、富集峰總之，用圖示的方法，可以看到該基因的此位點(diǎn)出現(xiàn)Peak峰（本質(zhì)上一種“歸一化后的”甲基化位點(diǎn)“富集峰”）12RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性

MeRIP-Seq測序?qū)嶒?yàn)簡易流程：1、差異處理的樣本一對(duì)或一組2、RNA提取3、mRNA純化4、mRNA片段化與純化5、mRNA-IP（RNA免疫共沉淀）6、mRNA-IP和mRNA-Control共同做mRNA-seq測序。注：mRNA-seq技術(shù)原理：首先從細(xì)胞或組織樣本中提取總RNA，其次將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA雙鏈文庫：

1）先用poly(T)寡聚核苷酸結(jié)合帶有poly（A）尾巴的mRNA分子，將其從樣品總RNA中分離出來；

2）將mRNA分子隨機(jī)打斷成更小長度的RNA片段，用逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成得到cDNA片段；

3）對(duì)cDNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，在將其兩端分別接上測序接頭，構(gòu)成用于測序的cDNA。再將cDNA測序文庫加入測序儀的各通道中，對(duì)cDNA進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增。mRNA-seq樣本要求，RNA：濃度大于等于400ng/ul，總量大于等于20ug；OD260/280在1.8~2.2,28S/18S大于1.8，RIN大于7。13RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性北京基因組研究所流程與上海晶能生物流程1、組織收集與制備

水稻愈傷組織Vs葉片（2014.9）、豬背部肌肉Vs皮下脂肪（2017.4）2、RNA的制備（RNA分離和片段化）

步驟一：樣品保存—切取兩類組織，保存收集和存儲(chǔ)在?80°C以下或液氮中，用于RNA提取。

步驟二：提取核酸—采用Trizol（Invitrogen）提取總RNA。使用核酸濃度檢測和凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。

步驟三：富集多聚腺苷酸mRNA—采用試劑盒Sigma、Invitrogen或者其他可用的mRNA純化試劑盒。

步驟四：化學(xué)片段化—富集的mRNA采用化學(xué)片段化方法，處理成約100nt大小。使用裂解緩沖體系FragmentationBuffer(Ambion,USA)，94℃孵育5分鐘，完成后使用，0.05MEDTA終止反應(yīng)，同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)的乙醇沉淀法沉淀核酸。片段化的核酸懸浮成約1ug/ul的水中，以備免疫沉淀和m6A測序。3、RNA免疫沉淀（IP）

步驟一：抗體結(jié)合—片段化的RNA（大約是2.5μg總RNA）和5mg純化的anti-m6A多克隆抗體(SynapticSystems,Germany)置于IPP緩沖液（150mMNaCl,0.1%NP-40,10mMTris-HCl,pH7.4）中，4℃孵育2h。同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)的乙醇沉淀法沉淀核酸-抗體。

步驟二：免疫結(jié)合—將免疫沉淀混合物與蛋白-A磁珠protein-Abeads(Repligen，USA)混合，4℃孵育2h。

步驟三：核酸洗脫—使用置于IPP緩沖液（150mMNaCl,0.1%NP-40,10mMTris-HCl,pH7.4）中的0.5mg/ml?N6-A(Sigma-Aldrich,USA)洗脫抗體結(jié)合的RNA。同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)的乙醇沉淀法沉淀核酸-抗體。4、IP-RNA和輸入RNA高通量測序（RNA-seq）

質(zhì)量檢測—RNA完整性使用（RIN）估計(jì)使用Nanodrop2000紫外可見（賽默飛，美國），質(zhì)量控制（QC）測試由安捷倫科技（美國）完成的。輸入方式—純化得到的IP樣本和實(shí)驗(yàn)前保留的2.5μg片段化總RNA，做為輸入RNA進(jìn)行RNA-Seq測序。上機(jī)方式—測序儀：HiSeq3000測序儀，測序試劑盒：基因組測序試劑盒V2（Illumina，美國）。RNABiol.2014Sep;11(9):1180–1188.BMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.14RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性第一步：差異樣本設(shè)計(jì)與獲得1、樣本要求—物種信息（僅限人、大小鼠、水稻等模式動(dòng)植物，其他物種需評(píng)估）；實(shí)驗(yàn)樣本：細(xì)胞、組織或提取后的總RNA。原則：限定有參基因組物種。2、樣本處理—梯度處理的樣本、組織特異性差異樣本。3、保存方式—液氮或-80℃低溫保存樣本，保證RNA完整性。4、樣本質(zhì)量—組織量≥100mg,植物組織≥200mg，血液量≥5ml，總RNA量≥300ug；總之，保證提取mRNA總量≥5ug。（按照每100ug總RNA中可以提取mRNA的量在2ug以上計(jì)算，每10mg動(dòng)植物組織可以提取總RNA的量在20ug計(jì)算，每1ml人全血可以提取總RNA的量3－5μg計(jì)算）于桉.磁性復(fù)合微粒在mRNA純化中的應(yīng)用[D].西北大學(xué),2007.第二步：總RNA提取1、實(shí)驗(yàn)原理：Trizol提取法，提取動(dòng)物組織、血液與植物幼嫩組織總RNA。CTAB法，提取植物組織。2、實(shí)驗(yàn)步驟：取適量組織（如上要求，保證mRNA總量≥5ug）進(jìn)行液氮研磨或組織勻漿的方法，按照“Trizol—異丙醇沉底法”提取總RNA。以30~50ulRNase-freeWater洗脫。孫博文.基于全轉(zhuǎn)錄組深度測序...mRNA..表達(dá)譜分析[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院..2016.3、質(zhì)量檢驗(yàn)：1）總RNA量≥300ug（按照每100ug總RNA中可以提取mRNA的量在2ug以上計(jì)算）。2）Nanodrop2000檢驗(yàn)核酸濃度和純度，OD260/280應(yīng)在1.8~2.1之間。2）凝膠電泳檢測核酸完整性，取1ulRNA樣品加入2ul5XLoadingBuffer，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，完整的RNA其28S與18S的亮度比例約為2:1。并形成RNA質(zhì)量報(bào)告。第三步：總mRNA的分離純化1、實(shí)驗(yàn)原理：oligo(dT)通過共價(jià)作用或鏈親和素—生物素的相互作用固定在磁性復(fù)合微粒材料上，并以此為載體開展從動(dòng)植物組織中純化mRNA。吸附下來的mRNA可以重新被洗脫下來（消除多聚A與多聚T的結(jié)合作用）。純化效率極高，有報(bào)道稱，磁珠法是纖維法的30~50倍。于桉.磁性復(fù)合微粒在mRNA純化中的應(yīng)用[D].西北大學(xué),2007.2、實(shí)驗(yàn)步驟：取計(jì)算好的總RNA適量（如上要求，保證mRNA總量≥5ug），按照市售mRNA純化試劑盒方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如Sigma、Invitrogen兩家的試劑盒。最終，得到總mRNA，以適當(dāng)體積RNase-freeWater洗脫。（試劑盒內(nèi)部包含有純化步驟，不用額外純化）。3、質(zhì)量檢測：不做檢測，直接進(jìn)入下一步?？尚行詧?bào)告與方案一15RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性第四步：總mRNA的化學(xué)片段化1、實(shí)驗(yàn)原理：采用化學(xué)片段化的方式，具體就是指，采用正、反向橋式探針，通過一步反轉(zhuǎn)錄及連接反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA樣本的打斷，且在反轉(zhuǎn)錄時(shí)同時(shí)引入兩端接頭，得到兩端帶有接頭的cDNA文庫。特點(diǎn)：取3～5ug總RNA樣品，使用探針法去除總RNA中的rRNA以富集mRNA。用正反橋式探針隨機(jī)雜交到mRNA上，并與溶液I混勻反應(yīng)，得到帶有兩端接頭、片段大小合適的cDNA，文庫插入片段的大小取決于相鄰兩個(gè)正反橋式探針的距離，即可以通過調(diào)整兩端接頭的比例及接頭和模板的比例，得到不同大小的cDNA文庫。申請(qǐng)人:深圳華大基因研究院申請(qǐng)?zhí)?CN2.3mRNA片段化方法...2、實(shí)驗(yàn)步驟：取上一步獲得的全部總mRNA，使用商品化試劑盒，裂解緩沖體系FragmentationBuffer(Ambion,USA)，94℃孵育5分鐘，完成后用0.05MEDTA終止打斷的酶反應(yīng)。然后，按照標(biāo)準(zhǔn)的乙醇沉淀法沉淀純化核酸。以適當(dāng)體積的（可以大體積洗脫）RNase-freeWater洗脫，濃縮至約1ug/ul（1000ng/ul），可以真空濃縮或者有適當(dāng)?shù)募铀P(guān)系（約5~10ul）。3、質(zhì)量檢測：Nanodrop2000檢驗(yàn)核酸濃度和純度，OD260/280應(yīng)在1.8~2.1之間，核酸的質(zhì)量應(yīng)當(dāng)在mRNA總量≥5ug的范圍內(nèi)。此時(shí)將片段化的總mRNA一分為二，一半2.5ug做RNA免疫沉淀（IP）；另一半2.5ug作為內(nèi)標(biāo)（Control）樣本保留下來。BMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.第五步：m6A位點(diǎn)的免疫共沉淀與富集（IP）1、實(shí)驗(yàn)原理：5mg純化的anti-m6A多克隆抗體可以有效的從2.5ug總mRNA中，富集含有m6A甲基化位點(diǎn)的片段化序列，這項(xiàng)技術(shù)在長期研究RNA甲基化的學(xué)術(shù)領(lǐng)域里，是成熟與耳熟能詳?shù)摹Ｈ缓?，蛋?A磁珠與抗體的結(jié)合，可以通過磁珠吸附的方式去除抗體和洗脫核酸。（也可以理解為，析出核酸與解除抗體結(jié)合）。2、實(shí)驗(yàn)步驟：取一半約重2.5ug總mRNA，按照商品化anti-m6A多克隆抗體試劑盒的要求，與5mg純化的anti-m6A多克隆抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。再按照商品化蛋白-A磁珠protein-Abeads(Repligen，USA)試劑盒的要求，與蛋白-A磁珠進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。最后，使用商品化的0.5mg/ml?N6-A(Sigma-Aldrich,USA)解除抗體結(jié)合作用，洗脫m6A甲基化位點(diǎn)片段化序列（IP樣本）。第六步：IP樣本與Control樣本輸入RNA-seq流程1、樣本輸入方式：將差異處理的A-B樣本，按照A-IP樣、A-Control樣；B-IP樣、B-Control樣共四個(gè)樣的方式進(jìn)行RNA-seq建庫測序流程。從逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成得到cDNA片段；對(duì)cDNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，在將其兩端分別接上測序接頭，構(gòu)成用于測序的cDNA。再將cDNA測序文庫加入測序儀的各通道中，對(duì)cDNA進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增。2、實(shí)驗(yàn)原理與步驟：RNA-seq建庫與測序。王鵬飛...轉(zhuǎn)錄組測序...關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá)分析[D].山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.可行性報(bào)告與方案二16RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性第七步：數(shù)據(jù)分析、Peaks峰分析、Motif基序分析、差異基因分析、GO功能分析1、實(shí)驗(yàn)原理：生信分析2、實(shí)驗(yàn)步驟：1）Reads統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)過濾、數(shù)據(jù)映射到參考基因組、尋找唯一映射；2）Peaks差異峰識(shí)別、Peaks差異峰統(tǒng)計(jì)；3）組織差異甲基化基因分析、m6A甲基化位點(diǎn)富集區(qū)Motif基序的偏搜索與可視化4）m6A甲基化位點(diǎn)全轉(zhuǎn)錄組分布、組織間分布差異5）甲基化基因GO功能分析、單獨(dú)分析轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因6）組織特異基因的GO功能分析、特異基因與信號(hào)通路的甲基化Peaks峰分析BMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.17RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性采購試劑方案1、總mRNA的分離純化——試劑盒如，試劑盒GenElutemRNAminiprepkit(Sigma-Aldrich,StLouis,MO,USA)，Sigma-Aldrich在全國有多家代理，比如：安諾倫（北京）生物科技有限公司。2、總mRNA的化學(xué)片段化——試劑盒如，F(xiàn)ragmentationBuffer(Ambion,Austin,TX,USA)，Ambionz在上海有多家代理，比如：上海拜力生物科技有限公司。3、anti-m6A多克隆抗體、蛋白-A磁珠、N6-A(Sigma-Aldrich,USA)——原料如，抗體：Purifiedanti-m6Apolyclonalantibody(SynapticSystems,G?ttingen,Germany)

，SynapticSystems在上海有多家代理，比如：上海起福生物科技有限公司。又如，蛋白-A磁珠：Protein-Abeads(Repligen,Waltham,MA,USA)，Repligen在上海有多家代理，比如：上海聚仕隆生物科技有限公司。4、mRNA建庫流程成熟如，mRNAsequencingkit(IlluminaInc.,SanDiego,CA,USA)，Illumina試劑在上海有多家代理，Illumina技術(shù)支持可提供mRNA建庫具體方案。18RNA甲基化研究現(xiàn)狀與實(shí)驗(yàn)可行性主要引用與技術(shù)路線參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)：1、技術(shù)路線：中國科學(xué)院北京基因組研究所研究了模式植物水稻全轉(zhuǎn)錄組RNA甲基化（愈傷組織Vs葉片）RNABiol.2014Sep;11(9):1180–1188.2、技術(shù)路線：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)和晶能生物采用公司服務(wù)的方式研究了豬（肌肉和脂肪組織）m6A甲基化譜RNABMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.3、綜述文章：西安交大利物浦大學(xué)生物科學(xué)系和西北工業(yè)大學(xué)在中國《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展》上發(fā)表名為《高通量RNA甲基化測序數(shù)據(jù)處理與分析研究進(jìn)展》的綜述文章4、綜述文章：芝加哥大學(xué)化學(xué)系和生物物理學(xué)研究所發(fā)表綜述文章《由可逆m6A甲基化RNA介導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制》NatRevGenet.2014May;15(5):293-306.5、MeDIP-seq技術(shù)路線：碩士論文—鄭州大學(xué)/中南大學(xué)；博士論文—復(fù)旦大學(xué)。6、轉(zhuǎn)錄組測序流程：碩士論文—北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)等。王鵬飛...轉(zhuǎn)錄組測序...關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá)分析[D].山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.孫博文.基于全轉(zhuǎn)錄組深度測序...mRNA..表達(dá)譜分析[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院..2016.7、mRNA片段化方法：參看華大基因?qū)＠墨I(xiàn)申請(qǐng)?zhí)?CN2.3申請(qǐng)人:深圳華大基因研究院mRNA片段化方法...8、總mRNA的分離純化方法于桉.磁性復(fù)合微粒在mRNA純化中的應(yīng)用[D].西北大學(xué),2007.