DPPH自由基清除/PTIO自由基清除實驗：實驗流程圖2018.4【前言】體內(nèi)（細(xì)胞內(nèi)）的自由基，可以分為兩類：活性氧（ROS，Reactiveoxygenspecies）和活性氮（RNS，Reactivenitrogenspecies）。ROS主要有羥基自由基·OH，過氧自由基(·O2-)，脂質(zhì)過氧自由基(LOO·)等；RNS主要有一氧化氮（·NO）等。這些ROS和RNS如果過量堆積，會引起氧化應(yīng)激，發(fā)生各種病變，加速機體衰老。許多植物（特別是中藥），對ROS和RNS都有較強的清除作用，這種清除作用可以緩解氧化應(yīng)激，故稱為抗氧化。為了評價抗氧化活性的強弱，生物化學(xué)家建立了一系列的評價方法。最常見的是DPPH自由基清除法。DPPH自由基結(jié)構(gòu)如下：其全稱有數(shù)個：（1）1,1-二苯基-2-三硝基苯肼基自由基；（2）1,1-二苯基-2-苦肼基自由基；（3）2,2-二苯基-1-苦肼基自由基；（4）2,2-二苯基-1-三硝基苯肼基自由基；（5）α,α-二苯基-β-苦肼基自由基。盡管如此，其簡稱都是“DPPH自由基”。RNS和ROS都是不穩(wěn)定的（如·OH，·O2-，LOO·，·NO），很難直接評價。不過，DPPH自由基較穩(wěn)定，因為N原子上那個成單電子，可以與苯環(huán)形成p-π共軛。穩(wěn)定的DPPH自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫紅色，并在519nm范圍有最大吸收峰。當(dāng)向DPPH自由基溶液中加入自由基清除劑(抗氧化劑)時，成單被配對，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H分子，其褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可以通過吸光度的變化進(jìn)行定量分析。當(dāng)DPPH自由基與抗氧化劑反應(yīng)后，519nm波長處的吸收值降低，其降低的程度與接收的電子（抗氧化劑清除自由基活性）呈定量關(guān)系，可以用分光光度計測定。不過，從結(jié)構(gòu)式中可以看也，其成單電子位于N原子上，所以，是RNS而不是ROS。所以，嚴(yán)格講，DPPH法只能用于評價RNS清除水平而不是ROS清除水平。如果要評價ROS清除水平，必須用相對穩(wěn)定的氧自由基。PTIO自由基，即是一種相對穩(wěn)定的氧自由基。由結(jié)構(gòu)式可知，PTIO自由基的成單電子是位于氧原子上的，而且，旁邊有大的π-π共軛體系，所以，其結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。其甲醇溶液呈深紫色，并在586nm范圍有最大吸收峰；其水溶液呈深紫色，并在557nm范圍有最大吸收峰。所以，既可以用水作溶劑，也可以用甲醇作溶劑。具體，則視樣品的溶解性而定。如果能將DPPH自由基清除和PTIO自由基清除相結(jié)合，則既能反映RNS清除水平，又能反映ROS清除水平。故，可以較全面地評價其抗氧化活性?！疚墨I(xiàn)】XicanLi.2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-oxide(PTIO?)Radical-scavenging:ANewandSimpleAntioxidant.Jour