微生物大小及數(shù)量的測定微生物大小及數(shù)量的測定摘要：本實(shí)驗(yàn)主要學(xué)習(xí)并掌握顯微測微尺測定微生物大小的方法和如何使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)量微生物細(xì)胞數(shù)量。關(guān)鍵詞：顯微測微尺顯微計(jì)數(shù)法血細(xì)胞計(jì)數(shù)板前言（一）微生物大小的測定微生物細(xì)胞大小，是微生物的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。由于菌體很小，只能在顯微鏡下測量。用來測量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺。鏡臺(tái)測微尺（圖1）是中央部分刻有精確等分線的載玻片。一般將1mm等分為100格，每格長度等于0．01mm（即106μm）。鏡臺(tái)測微尺并不直接用來測量細(xì)胞的大小，而是專用于校正目鏡測微尺每格的相對長度。目鏡測微尺（圖1）是一塊可放在接目鏡內(nèi)的隔板上的圓形小玻片，其中央刻有精確的刻度，有等分50小格或100小格兩種，每5小格間有一長線相隔。由于所用接目鏡放大倍數(shù)和接物鏡放大倍數(shù)的不同，目鏡測微尺每小格所代表的實(shí)際長度也就不同。因此，目鏡測微尺不能直接用來測量微生物的大小。在使用前必須用鏡臺(tái)測微尺進(jìn)行校正，以求得在一定放大倍數(shù)的接目鏡和接物鏡下該目鏡測微尺每小格的相對值，然后才可用來測量微生物的大小。圖1測微尺及其安裝和校正（二）微生物數(shù)量的測定顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點(diǎn)是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時(shí)間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖2。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格(圖2)；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。以25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例，設(shè)5個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，則：1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個(gè)）同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B（個(gè)）。圖2血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造示意圖1材料1.1菌種釀酒酵母，枯草芽孢桿菌。1.2溶液和試劑堿性美藍(lán)染液,香柏油，二甲苯。1.3儀器和其他用品目鏡測微尺，鏡臺(tái)測微尺，普通光學(xué)顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)器，載玻片，蓋玻片，擦鏡紙，接種環(huán)，酒精燈，毛細(xì)滴管，試管等。2實(shí)驗(yàn)步驟2.1微生物大小的測定2.1.1目鏡測微尺的安裝取出接目鏡，把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放入目鏡的隔板上．然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插回鏡筒內(nèi)(見圖1)。2.1.2校正目鏡測微尺將鏡臺(tái)測微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上，使有刻度的一面朝上，并將刻度對準(zhǔn)視野中央。先用低倍鏡觀察，對準(zhǔn)焦距，待看清鏡臺(tái)測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺(tái)測微尺的刻度相平行。利用推進(jìn)器移動(dòng)鏡臺(tái)測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，記錄兩次重疊刻度間目鏡測微尺與鏡臺(tái)測微尺的格數(shù)（圖1）。用同樣的方法換成高倍鏡和油鏡進(jìn)行校正，分別測出在高倍鏡和油鏡下，兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)。按下列公式分別計(jì)算出不同放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每格所代表的長度。目鏡測微尺每格長度（μm）=2.1.3菌體大小測定將鏡臺(tái)測微尺取下，分別換上枯草芽孢桿菌染色裝片及酵母菌涂片，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量枯草芽孢桿菌和酵母菌的寬度和長度。測定時(shí)，通過轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測微尺和移動(dòng)載玻片，測出菌體寬和長所占目鏡測微尺的格數(shù)。最后將測得的格數(shù)乘以目鏡測微尺（用油鏡時(shí)）每格所代表的長度，即為該菌的實(shí)際大小。2.1.4測定完畢測量完畢后取出目鏡測微尺，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺分別用擦鏡紙擦拭干凈，放回盒內(nèi)保存。2.2顯微計(jì)數(shù)法2.2.1菌懸液的稀釋將釀酒酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。2.2.2檢查血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在加樣前，先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。2.2.3加樣品將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。加樣后靜置5分鐘，時(shí)細(xì)胞或孢子自然沉降。取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。2.2.4顯微鏡計(jì)數(shù)將加有樣品的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算樣品的含菌量。2.2.5清洗使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干，放回盒中。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1微生物大小的測定3.1.1校正目鏡測微尺目鏡測微尺校正結(jié)果物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺(tái)測微尺格數(shù)目鏡測微尺每格代表的長度/μm低倍鏡1091011.111高倍鏡402052.500油鏡1004910.204注：目鏡放大倍數(shù)為10倍。3.1.2各菌測定記錄菌種釀酒酵母枯草芽孢桿菌長度1112131087寬度988111注：目鏡放大倍數(shù)為10倍，物鏡放大倍數(shù)為100倍。3.1.3各菌測定計(jì)算結(jié)果細(xì)菌名稱目鏡測微尺每格代表的長度/μm寬長菌體大小/μm2目鏡測微尺平均格數(shù)寬度/μm目鏡測微尺平均格數(shù)長度/μm枯草芽孢桿菌0.20410.208.31.690.34釀酒酵母0.2048.31.69122.454.143.2顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋倍數(shù)各中格菌數(shù)5個(gè)中格總菌數(shù)A1ml菌液中菌數(shù)12345釀酒酵母1056686063553021.51×1083.3結(jié)果分析在測量細(xì)菌大小的實(shí)驗(yàn)中，菌體的大小隨菌齡和環(huán)境條件而異,或讀數(shù)不準(zhǔn)確均會(huì)造成誤差。在顯微鏡計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，對菌液稀釋時(shí)稀釋倍數(shù)的不準(zhǔn)確把握和實(shí)驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)較少都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.4思考題3.4.1在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測定同一細(xì)菌的大小時(shí)其結(jié)果不相同，因?yàn)槲镧R放大倍數(shù)不同，使得目鏡測微尺每格代表的數(shù)值不同，精確度不一樣，因此數(shù)值不同。3.4.2血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)的誤差來源：計(jì)數(shù)室內(nèi)有氣泡將影響菌懸液隨機(jī)分布而使計(jì)數(shù)產(chǎn)生誤差，并且改變了菌懸液的總濃度；重復(fù)計(jì)數(shù)；遇到有出芽的酵母菌計(jì)為兩個(gè)。4小結(jié)使用鏡臺(tái)測微尺進(jìn)行校正時(shí)，若一時(shí)無法直接找到測微尺，可先對刻度