XXX無菌檢驗方法學驗證方案編號：VP.SV.039.00目錄驗證方案的審批驗證小組名單驗證實施進度技術(shù)性文件引言概述驗證目的職責無菌檢查方法學的確認再驗證周期

驗證方案審批方案起草簽名日期質(zhì)量監(jiān)控部方案審核簽名日期技術(shù)部質(zhì)量監(jiān)控部方案批準簽名日期質(zhì)量監(jiān)控部

驗證小組名單組長姓名成員職務部門成員姓名成員職務部門驗證實施進度驗證方案組織實施進度制定日期年月日實施日期年月日報告日期年月日技術(shù)性文件項目文件來源附錄XIH無菌檢查法2010版《中華人民共和國藥典》公司GMP文件

引言概述根據(jù)2010版《中華人民共和國藥典》二部附錄ⅪH規(guī)定，當建立藥品的無菌檢查方法時，需進行方法學的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的檢測。當藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢測方法應重新驗證。驗證目的：根據(jù)2010版《中華人民共和國藥典》二部附錄ⅪH無菌檢查方法要求，通過試驗，尋找合適的材料、條件和方法，最終確定氧氟沙星滴眼液的檢驗方法，并將其定為日常檢測的正式方法。職責驗證辦負責驗證方案的審批。負責驗證的協(xié)調(diào)工作，以保證驗證方案規(guī)定項目的順利實施。負責驗證數(shù)據(jù)及結(jié)果的審核。負責驗證報告的審核。負責再驗證周期的確認。質(zhì)量監(jiān)控部負責驗證所需的標準品、樣品、試劑、試液等的準備。負責儀器、儀表、量具的校正。負責取樣及樣品檢驗。負責收集各項驗證、試驗記錄，對結(jié)果進行分析，起草驗證報告，報驗證辦。負責擬訂驗證方案。負責組織試驗所需設(shè)備。負責按照驗證方案里各項操作步驟進行操作。負責保證設(shè)備的正常運轉(zhuǎn)。

無菌檢查方法學的確認驗證環(huán)境、設(shè)備及實驗前準備：無菌室內(nèi)（無菌檢查應在環(huán)境潔凈度B級下的局部潔凈度A級的單向流空氣區(qū)域或隔離操作器內(nèi)完成。由QA人員定期按國家相關(guān)要求進行環(huán)境監(jiān)控。儀器和設(shè)備：=1\*GB3①GSP-9080MBE型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；=2\*GB3②生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；=3\*GB3③AL204型電子天（梅特勒—托利多儀器有限公司）；=4\*GB3④GZX-9070MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；=5\*GB3⑤YXQ-LS-50SI型高壓蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；=6\*GB3⑥HTY-2000A集菌儀、全封閉集菌培養(yǎng)器可重復使用集菌培養(yǎng)器（杭州高得·泰林醫(yī)療器械有限公司）；=7\*GB3⑦超凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；。=8\*GB3⑧微孔濾膜（孔徑0.45μm直徑50mm）…供試品：品名規(guī)格批號劑型生產(chǎn)廠家所需培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（細菌培養(yǎng)）；批號：050104；靈敏度：應符合定廠家：北京三藥科技開發(fā)公司；改良馬丁培養(yǎng)基（真菌培養(yǎng)）；批號：050106；靈敏度：應符合規(guī)定廠家：北京三藥科技開發(fā)公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（分離單個菌落及傳菌種）；廠家：北京三藥科技開發(fā)公司；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)真菌及傳菌種）；廠家：北京三藥科技開發(fā)公司；稀釋液、緩沖液：0.9%氯化鈉溶液；PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(配制方法參照chp2005附錄—90頁)驗證用菌種：金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；大腸埃希菌[CMCC（B）44102]生孢梭菌[CMCC（B）64941]；枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]；黑曲霉[CMCC（F）98003]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]。（以上菌種均由湖北省藥品檢驗所提供）培養(yǎng)基的無菌檢查：培養(yǎng)基配制好并采取驗證合格的滅菌程序滅菌后隨機取5瓶(管)，培養(yǎng)14天，結(jié)果應無菌生長。方法學驗證:簡要方法說明：本品為喹諾酮類抗生素，通過抑制細菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和DNA復制而發(fā)揮作用。對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌均有較強的抗菌作用。由于本品為液體眼用制劑，且其組分中含強抑菌成分，故計劃使用薄膜過濾法，以PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液對本品進行方法學驗證。檢查方法：根據(jù)2010版《中華人民共和國藥典》規(guī)定：凡供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。（檢驗量：10瓶；供試品用量：20ml；培養(yǎng)基用量：100ml菌液的制備：（1）接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至100ml營養(yǎng)肉湯中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時，取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法稀釋，制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。（2）接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至100ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時，取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法稀釋，制成制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。菌懸液。。（3）接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3-5ml含0.05%（ml）聚山梨80的酯0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，用管口帶有薄的無菌棉花的無菌吸管吸出菌液，用裝有脫脂棉的小漏斗過濾，除去菌絲后收集菌懸液，用接種環(huán)取1環(huán)至10ml0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，取0.1ml接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，23～28℃培養(yǎng)72小時培養(yǎng)后制成制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的孢子懸液。（4）接種生孢梭菌新鮮菌懸液用10倍遞增稀釋法接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中30～35℃培養(yǎng)18～24小時，輕輕取此培養(yǎng)液，勿搖，觀察培養(yǎng)基中懸掛的燈籠狀菌落，計數(shù)，使菌數(shù)制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液菌落計數(shù)，（結(jié)果見相關(guān)記錄）取金黃色葡萄球菌菌液、大腸埃希菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液各1m1分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，生孢梭菌接種至含1．5％瓊脂的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃～35℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h，取白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液各1m1分別接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)23培養(yǎng)基接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，生孢梭菌，各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天，取每管9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu的白色念球菌，黑曲霉各2支，另一支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果。結(jié)果判斷空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)管菌生長良好，判斷該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。供試液的制備：無菌操作，取供試品10瓶，注入無菌錐形瓶內(nèi)混勻，取滴眼液原液10ml供一株試驗菌使用。試驗組(樣品+陽性)取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器(三聯(lián)裝)一套，先用少量pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕濾膜，取樣品15瓶溶解于100ml緩沖液中，按薄膜過濾法過濾，樣品過濾完畢后，再用pH7．0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次每管注入沖洗液100ml，充分振搖，完全排空后，總沖洗量達到500ml每管。沖洗完畢后在2管中分別注人改良馬丁培養(yǎng)基100ml，另1管中注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100ml。另取一套集菌培養(yǎng)器(三聯(lián)裝)取本品依上述方法過濾并沖洗后，均注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100ml，將上述6管集菌培養(yǎng)器移至陽性對照室，于含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器中，分別接種金黃色葡萄球菌菌液、大腸埃希菌茵液、枯草芽孢桿菌菌液、生孢梭菌菌液各1ml，于含改良馬丁培養(yǎng)基的集茵培養(yǎng)器中，分別接種白色念珠菌菌液和黑曲霉菌液各1ml，按前述規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5天，觀察結(jié)果。陽性對照組取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器(三聯(lián)裝)二套，4管中分別注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各100ml、2管中分別注入改良馬丁培養(yǎng)基各100ml，在陽性對照室內(nèi)將6種菌液分別接種至相應管內(nèi)，作為陽性對照，按前述規(guī)定溫度培養(yǎng)2～3天，觀察結(jié)果。陰性對照組取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器(二聯(lián)裝)一套，濾過適量緩沖液后分別注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基各100ml，作為陰性對照，按前述規(guī)定溫度培養(yǎng)14天，觀察結(jié)果。樣品的無菌檢查取樣品15支依上述方法同法操作，以500ml／管的沖洗量沖洗，加入培養(yǎng)基后，按規(guī)定溫度培養(yǎng)14天，逐日觀察，若培養(yǎng)14天均澄清；由此判定供試品符合規(guī)定。

結(jié)果及記錄：見相關(guān)報告結(jié)果判斷：試驗組各培養(yǎng)器中試驗菌與陽性對照組比較均生長良好，說明該供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用（或其抑菌作用可忽略不計），可以照此檢驗方法和檢驗條件進行該供試品的無菌檢查。如試驗組各培養(yǎng)器中試驗菌與陽性對照組比較至少有一種菌株生長微弱、緩慢或不生長說明該供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基用量，或使用中和劑或滅活劑，更換濾膜品種等方法，消除供試品抑菌作用，并重新進行方法學驗證。結(jié)論：檢查人：日期：復核人：