第六節(jié)

分子標記輔助選擇和轉基因育種一、分子標記輔助選擇育種（一）分子標記輔助選擇的基本原理（二）分子標記輔助選擇的基本流程（三）分子標記輔助選擇在水稻育種上的應用二、轉基因育種水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年變異：發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)造育種上有利的遺傳變異遺傳：采用合理先進的育種手段方法，將優(yōu)良基因重組在一起選擇：應用準確有效的選擇鑒定技術，篩選出優(yōu)良的重組類型植物育種基礎與環(huán)節(jié)(一)分子標記輔助選擇的基本原理一、分子標記輔助選擇育種F2P2F1P1x包含大量個體的分離群體表型鑒定和選擇供體受體常規(guī)育種苗期耐逆境鑒定抗病、蟲性鑒定營養(yǎng)元素利用效率鑒定F2F1xP2

ResistantP1

SusceptibleMethodwherebyphenotypicselectionisbasedonDNAmarkers分子標記輔助選擇育種借助分子標記對目標性狀的基因型進行選擇(育種)，稱為分子標記輔助選擇(育種)。Markerassistedselection(MAS)比表型鑒定方法簡單

表型鑒定需要花費大量勞動力的性狀

節(jié)約成本和勞力選擇時期自由，特別是早期選擇可加快選擇進程

如品質性狀等

開花前選擇可提早確定目標單株用于回交提高可信度

不受環(huán)境條件的影響

能區(qū)分雜合和純合單株。降低試驗成本，提高選擇效率

減少用地分子標記輔助選擇的優(yōu)勢目標基因的標記篩選(genetagging)是進行MAS育種的基礎。（二）分子標記輔助選擇的基本流程用于MAS育種的分子標記需具備3個條件：①分子標記與目標基因緊密連鎖(最好lcM或更小，或共分離)；②標記適用性強，重復性好，而且能經濟簡便地檢測大量個體(當前以PCR為基礎)；③不同遺傳背景選擇有效。1.獲得與目標性狀連鎖的標記(基因定位)遺傳作圖：采用遺傳學分析方法將基因或DNA標記順序標定在染色體上，從而構建連鎖圖的過程。1)遺傳圖譜的構建水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年選擇適合作圖的DNA標記選擇用于建立作圖群體的親本組合建立具有大量DNA標記處于分離狀態(tài)的分離群體測定作圖群體中不同個體或株系的標記基因型標記基因型數(shù)據(jù)連鎖分析構建標記連鎖圖遺傳作圖的主要步驟水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年根據(jù)其遺傳穩(wěn)定性可將分離群體分成兩大類：一類稱為暫時性分離群體，如F2、F3、F4、BC1、三交群體等，這類群體中分離單位是個體(單株)，一經自交或近交其遺傳組成就會發(fā)生變化，無法永久使用。另一類稱為永久性分離群體，如重組自交系（RIL）、加倍單位體（DH）群體等，這類群體中分離單位是株系，不同株系之間存在基因型的差異，而株系內個體間的基因型是相同且純合的，是自交不分離的。這類群體可通過自交或近交繁殖后代，而不會改變群體的遺傳組成，可以永久使用。分離群體的類型水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年P1xP2F1F1xP1(orP2)F1F1xP1(orP2)F1xP3F2BC1三交F1臨時性群體anthercultureRILBILDH永久性群體構建連鎖圖常用的試驗群體………親本1親本2×F1基因型分離群體（F2、BC1、DH和RIL等）篩選獲得在親本間呈多態(tài)性的分子標記利用這些多態(tài)性的分子標記對分離群體的各個單株進行基因型分析*T17533311203333003313311311*T9332333332332111131133313*C3533311203333003313311311*C6633311203333003313311311...計算機軟件如mapmarker等進行連鎖分析M1rkersDist1nce1T1754.2cM3C3515.0cM2T9311.9cM5C6612.2cM6T50243.2cM5m1rkerslog0likeli3ood=0424.94水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年選擇適合作圖的DNA標記SSR標記選擇用于建立作圖群體的親本組合XZ3150/CO39建立具有大量DNA標記處于分離狀態(tài)的分離群體RIL測定作圖群體中不同個體或株系的標記基因型標記基因型數(shù)據(jù)連鎖分析構建標記連鎖圖遺傳作圖的主要步驟水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年若標記覆蓋整個基因組2)質量性狀基因連鎖標記的篩選（基因定位）水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年質量性狀基因定位近等基因系分析法（NearIsogenicLine,NIL）群體分離分析法（Bulkedsegregantanalysis,BSA）

基因性狀表現(xiàn)型的BSA法基因標記基因型的BSA法極端集團隱性群法水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年近等基因系培育示意圖a.近等基因系分析法水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年如果一對近等基因系在目標性狀上表現(xiàn)差異，那么，凡是能在這對近等基因系間揭示多態(tài)性的分子標記，就可能與目標基因連鎖。近等基因系分析法的基本原理水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年依據(jù)目標性狀表型的相對差異（如抗病與感?。?，將個體或株系分成兩組，然后分別將兩組中的個體或株系的DNA混合，形成相對的DNA池。這兩個DNA池之間除了在目標基因座所在的染色體區(qū)域的DNA組成上存在差異之外，來自基因組其它部分的DNA組成是完全相同的。因此，在這兩個DNA池間表現(xiàn)出多態(tài)性的DNA標記，就有可能與目標基因連鎖。b.群體分離分析法的基本原理水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年圖4.3 BSA法分析原理示意圖.Bulk1，2指按目標性狀差異的分組；1，2，3，4指組中不同個體；L1，L2，L3分指不同座位，L3為目標座位；R，r為座位3（L3）中不同等位基因水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年原理：QTL定位實質上就是分析分子標記與QTL之間的連鎖關系，其基本原理是對個體的基因型（Maker基因型）進行分組，根據(jù)不同基因型組別的表型差異來推斷QTL與Marker是否連鎖。3)數(shù)量性狀基因座連鎖標記的篩選（QTL定位）QTL定位的主要方法有：均值差檢驗法（單標記法）性狀-QTL回歸法（區(qū)間法）性狀-QTL-標記回歸法（復合區(qū)間定位法）水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年Plantheight(cm)AAAaaa195197195F=0.48nsXMC(cm)BBBbbb206196187F=6.47**單標記法的原理①分子標記與目標基因共分離或緊密連鎖，一般要求兩者間的遺傳距離小于5cM，最好1cM或更小。②具有在大群體中利用分子標記進行篩選的有效手段，目前，主要應用自動化程度高，相對易于分析，且成本較小的PCR技術。③篩選技術在不同實驗室間重復性好，且具有經濟、易操作的特點。④應有實用化程度高并能協(xié)助育種家作出抉擇的計算機數(shù)據(jù)處理軟件。1）作物MAS育種需具備的條件2.作物MAS育種流程a.前景選擇b.背景選擇2）作物MAS育種的基本方法對目標基因的選擇稱為前景選擇（foregroundselection）a.前景選擇(1)單標記選擇(2)雙標記選擇

1

2

3

4Targetlocus

1

2

3

4分子標記必須與目標基因緊密連鎖MarkerA基因或QTL5cMMarkerA基因或QTLMarkerB5cM5cM理想的分子標記與目標基因的遺傳距離<5cM前景選擇的可靠性主要取決于標記與目標基因間連鎖的緊密程度。對基因組中除了目標基因之外的其它部分（即遺傳背景）的選擇，稱為背景選擇（backgroundselection）。b.背景選擇

1

2

3

4BACKGROUNDSELECTION與前景選擇不同的是，背景選擇的對象幾乎包括了整個基因組。要對整個基因組進行選擇，就必須知道每條染色體的組成。這就要求用來選擇的標記能夠覆蓋整個基因組，也就是說，必須有一張完整的分子標記連鎖圖。1.基因轉移2.基因聚合(三)分子標記輔助選擇在水稻育種上的應用基因轉移（genetransfer）或基因滲入（genetransgression）是指將供體親本中的有利基因（即目標基因）轉移或滲入到受體親本（一般為優(yōu)良品種或雜交親本）的遺傳背景中，從而達到改良受體親本個別性狀的目的。1.基因轉移基因轉移的常規(guī)育種手段：采用回交的方法，即將供體親本與受體親本雜交，然后以受體親本為輪回親本，進行多代回交，直到除了來自供體親本的目標基因之外，基因組的其它部分全部來自受體親本。1.基因轉移分子育種手段：同時進行前景選擇和背景選擇。常規(guī)育種手段和分子標記輔助選擇相結合前景選擇的作用：

保證從每一回交世代選出的作為下一輪回交親本的個體都包含目標基因?；蜣D移過程中前景和背景選擇的作用？背景選擇的作用：加快遺傳背景恢復成輪回親本基因組的速度，以縮短育種年限?？梢员苊饣驕p輕連鎖累贅針對番茄基因組進行的計算機模擬研究顯示，如果每一回交世代產生30個植株，那么，用分子標記對整個基因組進行選擇，只需3代即能完全恢復成輪回親本的基因型，而采用傳統(tǒng)的回交育種方法則需6代以上。==》背景選擇的重要性AB例假設A品種為普通品種，但含有2個抗病基因，而B品種為綜合性狀好的優(yōu)良品種，不含抗病基因?；亟挥N的目的是將A品種的抗病基因導入到B品種中。B（A）第一步，基因型分析，做出各個BC1植株的圖示基因型。以其中3個單株為例。第二步，前景選擇植株1只含一個來自親本A的抗病基因，所以在前景選擇中即被淘汰。植株2和3含有兩個抗病基因，都符合前景選擇的要求?！痢獭痰谌剑罕尘斑x擇植株3基因組中受體親本B的成分所占的比例較大，且每個目標基因附近都發(fā)生了重組，已去除了其周圍較大部分來自供體親本A的染色體成分。因此，在背景選擇中，以植株3更理想，用它作為下一輪回交的親本，可以更快恢復成親本B的基因組（除目標基因外）?！痢袒蚓酆希╣enepyramiding）就是將分散在不同品種中的有用基因聚合到同一個基因組中。2.基因聚合抗病育種中的應用如果能將抵抗不同生理小種的抗病基因聚合到一個品種中，那么該品種就具有抵抗多種生理小種的能力，亦即具有多抗性，這樣就不容易因致病菌優(yōu)勢小種的變化而喪失抗性。2.基因聚合傳統(tǒng)育種的困難：抗性鑒定需要人工接種，必須在一定的發(fā)育時期進行，并要求嚴格控制接種條件，操作困難。在基因聚合過程中，必須對不同的抗性基因分別進行鑒定，更增加了實際操作難度。MAS的優(yōu)點：用標記輔助選擇方法進行基因聚合則避免了上述困難。通過標記輔助選擇改良稻瘟病抗性例175-1-127(pi9)Jefferson(piz)谷梅2號(pigm)魔王谷(pi13)pi13Chr.11Chr.12Pi47Pi48湘資3150(pi47和pi48)水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年pi13RM7178RM19814SFP2-5AP5659.512M3456123456123456123456RM7178RM19814SFP2-5AP5659.5100bp200bp300bp400bp1-6分別代表魔王谷、谷梅2號、75-1-127、288、Jefferson和Tianye；M為DNALadder水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年優(yōu)質親本R288抗稻瘟病品種×F1R288×BC1…BC1F3，BC2F2，BC3F1，BC4BC1F8、BC2F7、BC3F6等

連鎖標記MAS…2011年轉移單個廣譜抗性基因的育種途徑聚合多個廣譜抗性基因的育種途徑？水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年部分抗病株系感病對照抗病鑒定圃水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年部分抗病優(yōu)質材料田間表現(xiàn)抗病優(yōu)質材料配制的雜交組合水稻育種第6節(jié)-分子標記輔助選擇和轉基因育種-2012年通過標記輔助選擇聚合水稻抗稻瘟病基因（Zhengetal.1995）。例2首先是應用分子標記技術將3個抗稻瘟病基因（Pi-2、Pi-1和Pi-4）在水稻第6、11和12號染色體上進行定位?；蚓酆显囼瀼?個近等基因系C101LAC、C101A51和C101PKT出發(fā)，它們分別帶有Pi-2、Pi-1和Pi-4基因。水稻轉基因育種根據(jù)育種目標，從供體生物中分離目的基因，經DNA重組與遺傳轉化或直接運載進入受體水稻品種，經過篩選獲得穩(wěn)定表達的遺傳工程體，并經過田間試驗與大田選擇育成轉基因新品種或種質資源。二轉基因育種與常規(guī)育種技術相比，轉基因育種在技術上較為復雜，要求也很高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢：1.拓寬可利用的基因資源；2.為培育高產、優(yōu)質、高抗品種提供嶄新的育種途徑；3.可以對植物的目標性狀進行定向變異和定向選擇；4.可以大大提高選擇效率，加快育種進程;5.可將水稻作為生物反應器生產藥物等生物制品。（一）轉基因育種的程序基因分離體外重組轉化轉化體安全性評價結合常規(guī)育種轉基因品種市場開發(fā)載體構建農桿菌介導基因槍轟擊篩選遺傳穩(wěn)定性評價1.目的基因的獲得(1)根據(jù)基因表達的產物—蛋白進行基因克隆(2)從基因組DNA或mRNA序列克隆基因根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類：a.同源序列法根據(jù)基因家族成員所編碼的蛋白質結構中具有保守氨基酸序列的特點克隆基因家族未知成員。b.表達序列標簽ESTEST是指能夠特異性標記某個基因的部分序列，包含了該基因足夠的結構信息區(qū)，可以與其它基因相區(qū)分。c.圖位克隆技術法d.轉座子標簽法e.差異顯示法在獲得外源基因的基礎上，要將其轉移到受體植株還必須對目的基因進行體外重組。外源重組的基本步驟包括：從原核生物中獲取目的基因的載體并進行改造；利用限制性內切酶將載體切開，并用連接酶把目的基因連接到載體上，獲得DNA重組體。2.載體(重組質粒)構建

受體是指用于接受外源DNA的轉化材料,常用的受體材料有以下幾大類型3.受體材料的選擇①愈傷組織再生系統(tǒng)②直接分化再生系統(tǒng)③原生質體再生系統(tǒng)④胚狀體再生系統(tǒng)⑤生殖細胞受體系統(tǒng)第一類:以載體為媒介的遺傳轉化，也稱為間接轉移系統(tǒng)法。最常見的轉基因方法。將外源基因重組進入適合的載體系統(tǒng)，通過載體將攜帶的外源基因導入植物細胞，整合在核染色體組中并隨核染色體復制和表達。農桿菌Ti質粒介導法是迄今為止植物基因工程中應用最多、機理最清楚、最理想的載體轉移方法。第二類:外源目的DNA的直接轉化a.化學刺激法:細胞融合劑如聚乙二醇、聚乙烯醇b.基因槍轟擊法c.微注射法4.轉基因方法5.轉化體的篩選和鑒定①轉化體的篩選使用特異性選擇標記基因進行標記，有效地選擇出真正轉化細胞。常用選擇標記基因：抗生素抗性基因和除草劑抗性基因。將選擇標記基因與適當啟動子構成嵌合基因，克隆到質粒載體上，與目的基因同時進行轉化。標記基因在受體細胞表達，使轉化細胞具有抵抗相應抗生素或除草劑的能力而存活下來。非轉化細胞則被抑制、殺死。②轉化體的鑒定a.DNA水平的鑒定檢測內容：是否整合、拷貝數(shù)。檢測方法：特異性PCR（以外源基因兩側序列設計引物）和Southern雜交鑒定目的基因是否整合到受體核基因組、是否表達？b.轉錄水平的鑒定

Northern雜交

RT-PCR檢測TPi9-82TPi9-15TPi9-811701UBITPi9-48Pi9LRRc.翻譯水平的鑒定

Western雜交免疫檢測基因分離體外重組轉化轉化體安全性評價結合常規(guī)育種轉基因品種市場開發(fā)載體的構建農桿菌介導基因槍轟擊篩選遺傳穩(wěn)定性評價

純系育種回交育種雜交育種雜交種6.轉化體的安全性評價和育種利用轉基因育種應用實例育種目標設計的依據(jù)：三系雜交水稻親本種子的混雜和退化，兩系雜交水稻制種的純度存在風險性。育種目標：將抗除草劑選擇標記基因導人恢復系品種，使雜交制種的真雜種具有抗除草劑特性，而假雜種對除草劑敏感。待雜交水稻種子播種后，在秧苗期噴施專用除草劑Basta,秧苗中出現(xiàn)黃葉直至枯死的植株為不抗除草劑的假雜種，真雜種得以保留，在秧苗期甚至種子階段將假雜種區(qū)分開來,用于種子純度檢測和去除假雜種，從而保證種子純度。轉基因育種應用實例育種技術途徑：a.發(fā)掘與克隆抗除草劑基因自然界中發(fā)現(xiàn)有許多除草劑很快被土壤