11三月2024芳酸及其酯類藥物的分析基本要求

一、掌握水楊酸類、苯甲酸類藥物的鑒別和含量測定的基本原理與方法。二、熟悉其他芳酸類藥物鑒別和含量測定的基本原理與方法。三、了解本類藥物的體內(nèi)分析方法。典型藥物鑒別試驗含量測定體內(nèi)藥分練習與思考雜質(zhì)檢查苯甲酸（鈉）一、苯甲酸類甲芬那酸丙磺舒典型藥物分類與理化性質(zhì)羥苯乙酯阿司匹林水楊酸雙水楊酯對氨基水楊酸鈉貝諾酯二、水楊酸類三、其他芳酸類

氯貝丁酯布洛芬酸性較弱主要理化性質(zhì)1.溶解性:

游離型芳酸或酯類不溶于水。2.UV和IR特性：具有苯環(huán)，用于鑒別或含量測定。3.酸性：pH3-6，受取代基的影響。其它芳酸類酸性較弱pKa=2.95pKa=3.49pKa=4.26一、與鐵鹽反應(yīng)二、重氮化-偶合反應(yīng)三、氧化反應(yīng)四、水解反應(yīng)五、分解反應(yīng)六、紫外分光光度法七、紅外分光光度法八、TLC和HPLC

第二節(jié)鑒別試驗

與三氯化鐵反應(yīng)1.水楊酸類：2.苯甲酸類：3.其它芳酸類：a）氯貝丁酯b）布洛芬藥物類型反應(yīng)條件鑒別要點水楊酸（鹽）中性、弱酸性（pH4-6）紫色配合物苯甲酸鹽中性或堿性赭色沉淀丙磺舒少量NaOH，溶解米黃色沉淀布洛芬高氯酸羥胺+DDC，加熱20min紫色羥肟酸鐵配合物氯貝丁酯鹽酸羥胺+KOH，加熱，+HCl紫色羥肟酸鐵配合物凡是分子結(jié)構(gòu)中含有芳伯氨基或潛在芳伯氨基的藥物均可反應(yīng)。重氮化-偶合反應(yīng)1.直接反應(yīng)：對氨基水楊酸鈉2.水解后反應(yīng)：貝諾酯具有潛在芳伯氨基，酸水解后再重氮化

+K2Cr2O7

深藍色

棕綠色甲芬那酸+H2SO4

黃色

綠色熒光△氧化反應(yīng)

1.ASA酸水解生成SA和CH3COOH：SA的mp為156℃～161℃。

2.雙水楊酯水解生成SA：SA的mp為158℃。水解反應(yīng)

1.苯甲酸鹽加熱分解生成苯甲酸升華物，可用于鑒別。

2.丙磺舒與NaOH熔融分解成Na2SO3,經(jīng)硝酸氧化成Na2SO4。

3.丙磺舒加熱分解，生成SO2氣體，有臭味分解產(chǎn)物反應(yīng)

1.測定λmax；λmin。

例如：布洛芬用0.4%NaOH溶液制備0.25mg/ml；λmax:265nm,273nm;λmin:245nm,271nm。

2.在λmax處測定一定濃度供試液的吸收度A。

例如：羥苯乙酯，5μg/mlλmax=295nm;A=0.48

3.在λmax處測定供試液的百分吸收系數(shù)。

例如：貝諾酯在λmax=240nm;E1%1cm=730~760

紫外吸收光譜法

4.在規(guī)定的波長測定吸收度比值（即雙波長吸收度比值法）

例如：對氨基水楊酸鈉10μg/ml;A265/A299=1.56~1.56再例如：甲芬那酸14μg/ml;A278~280/A348~352=1.15~1.30

七、紅外吸收光譜法水楊酸的紅外吸收圖譜3300~2300cm-1

N-H、

O-H1660cm-1

C=O1610,15701480,1440

C=C775cm-1

Ar-H3700~29001640

N-H1580cm-11500cm-1

C=C1300cm-1

C-N1188cm-1

C-O對氨基水楊酸鈉的紅外吸收圖譜一、阿司匹林中特殊雜質(zhì)的檢查第三節(jié)特殊雜質(zhì)檢查1.合成工藝2.水楊酸——反應(yīng)中間體與水解產(chǎn)物，利用SA可與高鐵鹽呈紫堇色，而乙酰水楊酸不含游離酚羥基，不與高鐵離子反應(yīng)。取一定量樣品和水楊酸對照品與硫酸鐵銨反應(yīng)，用比色法檢查。3.易炭化物檢查主要檢查ASA中能被硫酸炭化顯色的低分子有機雜質(zhì)。采用與標準比色液比色的方法檢查。1.溶液的澄清度——檢查原料（苯酚）和副產(chǎn)物（苯酯），利用這些物質(zhì)不溶于Na2CO3的性質(zhì)。2.檢查1.間氨基酚——反應(yīng)中間體和降解產(chǎn)物，并且容易進一步氧化，顏色加深。二、對氨基水楊酸鈉中特殊雜質(zhì)的檢查2.檢查方法：1）雙相滴定法：（Ch.P）間氨基酚溶于乙醚，對氨基水楊酸鈉不溶乙醚；乙醚提取加適量水和指示劑，鹽酸滴定，生成物在乙醚中不溶于是轉(zhuǎn)移到水相中。2）HPLC法：采用內(nèi)標法，以磺胺作內(nèi)標（USP）

甲芬那酸是以鄰-氯苯甲酸和2，3-二甲基苯胺在Cu的催化下縮合而成，因此成品藥物中要檢查銅鹽及有關(guān)物質(zhì)。分光光度法：利用Cu2+與Na-DDC呈色后測定A

1.銅鹽檢查法

原子吸收分光光度法：BP（2000）

2.有關(guān)物質(zhì)的檢查主要檢查的是酰胺、二甲基苯胺和鄰氯苯甲酸各國藥典均采用TLC法中的自身高低濃度對照法。三、甲芬那酸中特殊雜質(zhì)的檢查四、氯貝丁酯中特殊雜質(zhì)的檢查

主要檢查成品藥物中殘留的對氯酚原料和揮發(fā)性雜質(zhì)GC-FID法HPLC法：以對-羥乙基酚作內(nèi)標，用正相HPLC2.揮發(fā)性雜質(zhì)的檢查方法

GC法1.對氯酚檢查返回（一）直接滴定法——基于此藥物酸性較強酸堿滴定法：水楊酸類1.原理：2.條件：在中性乙醇中，以酚酞作指示劑；。摩爾比為1:1。3.注意事項：1）乙醇對酚酞顯酸性使結(jié)果偏高，所以乙醇在使用之前需用NaOH中和至對酚酞顯中性；2）滴定時振搖要快，防止局部堿液濃度過高使酯鍵水解；3）專屬性差，易受降解產(chǎn)物水楊酸和醋酸的干擾，所以不適合降解產(chǎn)物含量較高的樣品測定。一、阿司匹林（二）水解后剩余滴定法（USP、JP）原理：條件：水溶液

（三）兩步滴定法（Ch.P用于阿司匹林片的測定）

原因：片劑中有穩(wěn)定劑酒石酸或枸櫞酸，此外工藝中可能產(chǎn)生水楊酸和醋酸，不能采用直接滴定或水解后剩余滴定。第一步：用NaOH中和所有的游離酸，不計量

第二步：水解與測定，采用剩余滴定法

對氨基水楊酸鈉有芳伯氨基,在HCl中與NaNO2發(fā)生重氮化反應(yīng)Ar-NH2+NaNO2+2HClAr-N2Cl+NaCl+2H2O

因此可用亞硝酸鈉滴定法測定其含量，此法在下章重點討論。（二）亞硝酸鈉滴定法（三）雙相滴定法：（苯甲酸鈉）

這是有機酸堿金屬鹽類的常用測定方法，在水和與水不相混溶的有機溶劑（乙醚）中用標準酸進行滴定。

生成的苯甲酸不溶于水，終點pH突躍不明顯，不易觀察。苯甲酸在乙醚中易溶，在水相中加入乙醚將滴定中產(chǎn)生的苯甲酸萃取入醚層。因此用雙相滴定可使反應(yīng)完全終點明顯。（一）直接紫外分光光度法

貝諾酯的含量=CxD/m=紫外分光光度法（二）離子交換-紫外分光光度法氯貝丁酯及其制劑USP(2005)采用酸堿滴定法。含有酸性雜質(zhì)對氯酚時，可采用強堿性陰離子交換樹脂吸附酸性雜質(zhì)后紫外測定（USP（29））陰離子交換樹脂是在分子中含有堿性基團的離子交換樹脂。在水或極性溶劑中能溶脹,在水中具有堿性,能以其氫氧根離子或非金屬離子交換溶液中的陰離子。含有氫氧根離子的樹脂,根據(jù)電離常數(shù)的大小,可分為強堿性、中等堿性和弱堿性三類。強堿性陰離子交換樹脂,主要是分子中含有季銨基-N(CH?)3OH的樹脂。弱堿性陰離子交換樹脂,有間苯二胺-甲醛樹脂、三聚氰胺-胍·甲醛樹脂等。（三）柱分配色譜-紫外分光光度法

USP(29)采用此法同時測定ASA膠囊中ASA和SA。

1.SA的限量測定

色譜柱的制備；對照品溶液的制備；供試品溶液的制備。供試品液：CHCl3液洗脫液1：CHCl3洗脫液2：HAC-乙醚硅藻土，F(xiàn)eCl3-尿素玻璃棉硅藻土，Na2CO3供試品液：CHCl3-HCl液洗脫液1：HAC-CHCl3

(1:10)10ml洗脫液2：HAC-CHCl3(1:100)85ml

1-雜質(zhì)先洗脫2-SA后洗脫

max=306nmAu＜As1-雜質(zhì)先洗脫2-ASA后洗脫

max=280nmASA(mg)=C(Au/As)

2.ASA的含量測定色譜柱的制備；對照品溶液的制備；供試品溶液的制備。

Ch.P(2005)ASA的膠囊劑的含量測定采用此法。USP（24）ASA片、對氨基水楊酸鈉、甲芬那酸、布洛芬、丙磺舒等及其制劑，采用此法。五、HPLC法

一、血清中ASA和SA濃度的HPLC法

色譜條件：色譜柱為ODS-C18(150mm×4.6mm,5μm)流動相為甲醇-水-正丁醇(30:20:1)檢測波長為237nm；內(nèi)標物為苯甲酸。

血清樣品預(yù)處理

血清100μl+HClO450μl+不同濃度ASA和SA+內(nèi)標液渦旋混合2min離心5min取上清液20μl進樣。

第五節(jié)

體內(nèi)藥物分析回歸方程：以峰高比（H標/H內(nèi)）對濃度回歸ASA的回歸方程：Y=5.8×10-3+5.29×10-2Xr=0.9996SA的回歸方程：Y=6.0×10-3+8.33×10-2Xr=0.9981ASA和SA的線性范圍分別為：1～20μg/ml;2～30μg/ml回收率：空白血清+五種不同濃度測定，ASA為96.0%～106.0%;SA為92.0%～119.5%;（五種不同濃度均應(yīng)在線性范圍內(nèi)）色譜條件：色譜柱為LiChrospher100RP(125mm×4mm,5μm)流動相為25%乙腈溶液-醋酸緩沖溶液梯度洗脫。檢測波長為254nm；內(nèi)標物為依他尼酸。尿樣品預(yù)處理：C8固相萃取柱，100mg填料/ml用甲醇1.0ml,然后用0.5ml蒸餾水活化。2.0ml尿樣+內(nèi)標300μl(10μg/ml)上柱1.0ml水洗脫生物雜質(zhì)再用甲醇0.5ml洗脫保留在柱上的丙磺舒和內(nèi)標。洗脫液0.45μm浸濾膜濾過，取5μl直接進樣分析。

二、尿中丙磺舒的固相萃取凈化-HPLC法(運動員違禁藥物)線性關(guān)系和回收率：

取空白尿樣2.0ml+不同濃度丙磺舒+內(nèi)標液按上述方法分析(濃度范圍為0.1μg/ml～100μg/ml);A丙/A內(nèi)對C丙回歸?；厥章剩罕鞘鏋?00%±3%(n=14)；內(nèi)標為101%±3%(n=12)；人尿樣測定：丙磺舒(單劑量500mg)尿排泄藥-時曲線(見P136)

三、HPLC法測定人血漿中布洛芬含量

色譜條件：色譜柱為Shim-packCLC-ODS(150mm×6mm,10μm)