中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準出口食品及飲料中常見小漿果成分的檢測方法實時熒光PCR法第5部分：蔓越莓和藍莓國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局ISN/T4849《出口食品及飲料中常見小漿果成分的檢測方法實時熒光PCR法》系列標準共分為6部分：——第1部分：藍莓；——第2部分：樹莓；——第3部分：黑加侖；——第4部分：桑葚；——第5部分：蔓越莓和藍莓；——第6部分：獼猴桃。本部分為SN/T4849的第5部分。本部分按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別這些專利的責任。本部分由中華人民共和國國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本部分起草單位：中國檢驗檢疫科學研究院。1出口食品及飲料中常見小漿果成分的檢測方法實時熒光PCR法第5部分：蔓越莓和藍莓1范圍SN/T4849的本部分規(guī)定了出口食品及飲料中蔓越莓和藍莓成分的檢測方法實時熒光PCR法。莓為原輔料的食品及飲料中蔓越莓和藍莓成分的定性檢測(清汁及果酒除外)。本部分所規(guī)定方法的最低檢出限(LOD)為1%(體積比)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學檢測GB/T27658—2011藍莓3.1術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。漿果是指由一個子房或聯(lián)合其他花器發(fā)育成的柔軟多汁的肉質(zhì)單果，由一個或幾個心皮形成。小漿果則泛指果實較小、多汁的一類漿果。分為大果紅莓苔子(美洲蔓越橘)(Vacciniummac-rocarpon),小果紅莓苔子(毛蒿豆)(Vacciniummicrocarpum),紅莓苔子(北方蔓越橘)(Vacciniumoxycoccus),紅果扁枝越橘(南方蔓越橘)(Vacciniumerythrocarpum)4個品種群。2ifolium×Vacciniumc下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)。PCR:聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction)。Ct值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。dNTP:脫氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleosidetriphosphate)。dATP:脫氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate)。dCTP:脫氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate)。dGTP:脫氧鳥苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate)。dTTP:脫氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate)。UNG:尿嘧啶N-糖基化酶(uracilN-glycosylase)。CTAB:十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide)。Tris:三羥甲基氨基甲烷[Tris(Hydroxymethyl)aminomethane]。EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)。Taq:水生棲熱菌(Thermusaquaticus)。OD:光度密度(opticaldensity)。4方法提要取DNA。以蔓越莓或藍莓果實為陽性對照，以其他水果DNA為陰性對照，無菌水作為空白對照。使用特異性引物進行實時熒光PCR擴增，通過實時熒光信號曲線判定是否存在蔓越莓或藍莓成分。5試劑和材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實驗用水符合GB/T6682的要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。5.1檢測用引物和探針：蔓越莓和藍莓成分擴增引物和探針、內(nèi)參照(顯花植物NADH基因)引物和探針詳見表1。蔓越莓和藍莓擴增靶標序列參見附錄A。表1蔓越莓和藍莓序列引物探針物種名稱引物/探針序列(5'→3')擴增片段長度靶基因內(nèi)參照F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACANADHdehydrogenasesubunitB(ndhB)geneR:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCAP:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1蔓越莓和藍莓F:CATTTTAGCTTCAAATGGTTCGTCTmaturaseK(matK)R:TGAGTCCGTACCATTGAAGGTTTTAP:FAM-ACGCTTGAAAGATAGCCCAGAAAGTCGAA-TAMAR35.4CTAB提取緩沖液：20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNa?EDTA,5.670%乙醇(體積分數(shù))。5.8蛋白酶K(20mg/mL)。5.9實時熒光PCR反應(yīng)混合液：12.5μL反應(yīng)體系包括：1U～2U(Unit,酶學單位)的Taq酶、1×TPs、0.2mmol/L～0.4mmol/LdUTP,400nmol/LROX染料。6儀器設(shè)備6.2核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.3恒溫水浴鍋。果汁樣品取適量15000r/min離心30min,取沉淀部分。取50mg～500mg樣品，加入1mLCTAB提取緩沖液，同時加入0.01倍體積的20mg/mL蛋白酶K,65℃溫育1h～2h,期間不時震蕩混勻，應(yīng)保證樣品自由懸浮于液體中，必要時再加入適量CTAB提取緩沖液；取出后12000r/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清至2mL離心管中，加入0.7倍體積的三氯甲烷，劇烈震蕩混勻，12000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min;轉(zhuǎn)移上清至另一滅菌的離心管中，再加入0.7倍體積的三氯甲烷，劇烈震蕩混勻，室溫下12000r/min離心10min;轉(zhuǎn)移上清至干凈離心管中，加入等體積的CTAB沉淀液混勻，室溫沉淀1h;13000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min;棄上清，加入350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀；加入0.8倍體積的異丙醇或2倍體積—20℃冰箱中預(yù)冷的無水乙醇混勻，-20℃放置30min,12000r/min4℃離心10min,棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000g4℃離心10min,棄上清，室溫下晾干。加入50μL～100μL雙蒸水，室溫10min,混勻，4上述模板DNA均可用等效DNA提取試劑盒提取。7.3DNA濃度和純度的測定使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)z?和A?s。DNA的濃度按照式(1)計算：c=A×N×50/1000 式中：c——DNA濃度，單位為微克每微升(pg/μL);A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。當A?o/Aza?比值在1.7～2.0之間時，適宜于PCR擴增。7.4.1每個試樣PCR反應(yīng)應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。表2實時熒光PCR反應(yīng)體系試劑體積實時熒光PCR反應(yīng)混合液正向引物(10μmol/L)DNA模板(5ng/μL～100ng/μL)滅菌ddH?O7.4.3實時熒光PCR反應(yīng)程序按如下條件進行：a)內(nèi)參照基因：50℃2min;95℃預(yù)變性10min;95℃15s,60℃1min,40個循環(huán)。b)蔓越莓和藍莓matk基因：50℃2min;95℃預(yù)變性10min;95℃15s,60℃1min,45個循環(huán)。7.5對照反應(yīng)7.5.1所有試樣均應(yīng)同時設(shè)置平行的內(nèi)參照檢測與蔓越莓和藍莓特異性檢測，各體系中除引物探針外，其余組分及反應(yīng)條件均與7.4一致。7.5.2在試樣PCR反應(yīng)的同時，應(yīng)設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照，各對照反應(yīng)體系中，除模板外，其余組分及反應(yīng)條件應(yīng)與7.4一致。8質(zhì)量控制以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效：a)空白對照：無熒光對數(shù)增長，相應(yīng)的Ct值>45.0。5b)陰性對照：無熒光對數(shù)增長，相應(yīng)的Ct值>45.0。c)陽性對照：有熒光對數(shù)增長，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，相應(yīng)的Ct值≤30.0。9結(jié)果判斷與表述9.1結(jié)果判定在符合第8章的情況下，結(jié)果判定如下：a)Ct值≤40,則判定為陽性。b)40<Ct值<45,則重復(fù)實驗一次。再次擴增后，Ct值<45,應(yīng)查看相應(yīng)的擴增曲線并結(jié)合熒光信號判定結(jié)果；Ct值≥45,則判定為陰性。c)Ct值≥45,則判定為陰性。9.2結(jié)果表述10檢測過程中防止交叉污染的措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。6CATTTTAGCTTCAAATGGTTCGTCTCTTTTGATGAATAAATGGAAATATTACCTTGTCAATTTCTGGGAATGTTATTTTTCCATATGGGCTCAACCAAGAAGGATCCATATAAACCAATTATCCAATAATTCCTTCGACTTTCTGGGCTATCTTTCAAGCGTACGATTA