關于重組導入受體細胞1.DNA導入細菌的方法2.DNA導入酵母的方法3.DNA導入植物細胞的方法4.DNA導入動物細胞的方法第2頁,共26頁，2024年2月25日，星期天轉化轉染轉導接合轉移1.重組體導入細菌細胞（1）大腸桿菌重組質粒DNA分子進入受體細胞，并在受體細胞內穩(wěn)定維持和表達的過程稱之為轉化（transformation)。轉化不僅適合于大腸桿菌受體細胞，而且適合于枯草桿菌和藍藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受體細胞。

化學誘導感受態(tài)法電轉化感受態(tài)細胞（competencecell）是指處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)的細胞。★★第3頁,共26頁，2024年2月25日，星期天I.化學誘導感受態(tài)法

原理：E.coli細胞處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，細胞膨脹成球形，細胞膜形成液晶結構，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃短時間熱沖擊處理，液晶結構被擾動而使細胞膜出現(xiàn)間隙，促使DNA復合物進入細胞，在豐富培養(yǎng)基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，被轉化的細菌中，重組子中基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉化子。第4頁,共26頁，2024年2月25日，星期天Ca2+處理的感受態(tài)細胞，其轉化率一般能達到106～108轉化子/

gDNA?；瘜W法簡單、快速、穩(wěn)定、重復性好，感受態(tài)細菌可以在-70℃保存，但轉化DNA大小有限制，不同物種需要不同的誘導方法。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩(wěn)定地遺傳給后代。第5頁,共26頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸感受態(tài)細胞制備

制備感受態(tài)菌必須使用對數生長期的菌，且必須在冰冷的條件下制備。CaCl2處理充分，使細菌細胞膜失去一些蛋白。

儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下，使用感受態(tài)菌時必須迅速融化，融化后一般不能再次凍存使用第6頁,共26頁，2024年2月25日，星期天10ng質粒DNA100

L感受態(tài)菌冰上混合，靜置10分鐘42oC1分鐘冰浴2min，加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時10-100

L轉化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA轉化過程第7頁,共26頁，2024年2月25日，星期天II.電轉化

可以轉化大分子DNA（>50Kb)，胞壁較厚的物種需要制備原生質體后電轉化電穿孔轉化法最早用于將DNA導入真核細胞，1988年，Dower等人成功地應用該法進行了大腸桿菌的轉化。原理:利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔(electroporation),形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的有效吸收。電穿孔轉化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數的影響，通過優(yōu)化這些參數，每微克DNA可以得到109～1010轉化子。電壓增高或電脈沖時間延長時，轉化效率將會提高，但受體細胞存活率會降低。研究表明，當電場強度和脈沖時間的組合方式導致50%～70%細菌死亡時，轉化效率達到最高?！锏?頁,共26頁，2024年2月25日，星期天LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，4℃離心集菌冰冷的水重懸菌體4℃離心集菌冰冷的水重懸菌體4℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸細胞分裝成50

L電轉儀調為2.5kV,25

F脈沖控制器200-400

0.5

g質粒DNA混合、冰浴加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘涂布轉化細胞制備：電轉化：第9頁,共26頁，2024年2月25日，星期天用于電穿孔轉化法的細胞處理要比感受態(tài)細胞的制備要容易，當細菌生長到對數中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細胞懸浮液的離子強度，并用10%甘油重懸細胞，使其細胞濃度為3×1010個／ml，分裝，在干冰上速凍后置于-70℃貯存。每小份細胞融解后即可用于轉化，有效期達6個月以上一般電穿孔轉化須在低溫下（0～4℃）進行，轉化效率要比在室溫下操作提高約100倍。由于細菌細胞相對較小，因此與DNA導入真核細胞時相比，大腸桿菌的電轉化要求有更高的場強，而反應體積則相對要小，以20～40μl為宜。第10頁,共26頁，2024年2月25日，星期天磷酸鈣-DNA共沉淀法：簡稱磷酸沉淀法，屬于轉染法，能把外源基因與λ噬菌體DNA的重組子導入大腸桿菌和哺乳動物細胞，但轉染效率遠遠不如體外包裝法（轉導）。

HEPES緩沖鹽水與含有氯化鈣和DNA的溶液緩慢混合，會形成含磷酸鈣和DNA的沉淀。細胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNA的能力，幾乎所有的雙鏈DNA都可以通過這種方法導入細胞。

對數生長期的細菌和重組λ噬菌體磷酸鈣-DNA沉淀混合，先置0℃冰浴30～60分鐘，再放45℃中水浴5分鐘，使細菌迅速發(fā)生熱休克，以利外源DNA的進入。隨后涂布瓊脂平皿，培養(yǎng)后觀察并選取含有重組DNA的細菌。

轉染——磷酸鈣-DNA共沉淀法HEPES:4-羥乙基哌嗪乙磺酸;N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸★第11頁,共26頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（2）枯草芽孢桿菌Spizzen感受態(tài)轉化原生質體轉化電轉化枯草芽孢桿菌可以形成自然感受態(tài)，在對數生長后期由信息素激發(fā)一種二元信號傳導系統(tǒng)的調節(jié)，激活一系列感受態(tài)相關基因的表達。Spizzen在1958年發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象并發(fā)展了感受態(tài)轉化的方法.基本步驟：細胞在較為豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長后期，然后轉接到營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中，可使其形成感受態(tài)（一般非常短暫）I.Spizzen感受態(tài)轉化★第13頁,共26頁，2024年2月25日，星期天在枯草芽孢桿菌中，轉化的過程包括外源DNA的吸附、斷裂、吸收降解和重組（或形成獨立的復制單元，如質粒）幾個階段：吸附：這一過程發(fā)生在感受態(tài)細胞的表面，是一個非共價結合的過程。在枯草芽孢桿菌的感受態(tài)細胞表面平均約有50個DNA吸附位點，這些位點對雙鏈DNA有非常大的親和力雙鏈DNA的斷裂：在吸附發(fā)生后的30秒內，DNA被核酸酶隨機斷裂，其平均長度約為7kb。DNA的降解和吸收：在斷裂發(fā)生之后，雙鏈DNA的一條鏈被完全降解，另一條鏈穿過細胞壁和細胞膜后進入胞內。合成雙鏈并環(huán)化：變成雙鏈后依靠同源區(qū)環(huán)化。自身無同源區(qū)段（重復序列）的DNA，轉化效率極低。對于質粒單體，需要體外酶切、連接成質粒多聚體才能高效轉化。103~105個/gDNA缺點：對于生長差別較大的菌株需要重新確定轉接培養(yǎng)時間；酶切后質粒無法轉化。由于需要借助同源重組來重新環(huán)化質粒，對于recA缺陷菌株轉化效率非常低★第14頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

原理：用溶菌酶等處理消化部分細胞壁，制備原生質體，在PEP(聚乙二醇）等促溶劑作用下使細胞膜形成小孔，胞外DNA通過小孔進入胞內,然后在再生培養(yǎng)基上篩選轉化子。II.原生質體轉化

優(yōu)點：不需要質粒有自身同源區(qū)，因此對于單體質粒的轉化效率也很高（106個/微克DNA

）缺點：轉化效率隨質粒分子量變大而減小；部分抗生素在再生培養(yǎng)基失去篩選作用（例如卡那霉素在DM3培養(yǎng)基中無效）不適用于革蘭氏陰性菌III.電轉化

原理、步驟和大腸桿菌電轉化一樣，但轉化效率很低(<106個/微克DNA)

★第15頁,共26頁，2024年2月25日，星期天2.酵母菌的轉化方法（1）原生質體轉化法早期酵母菌的轉化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質球轉化法。在Ca2+和PEG的存在下，轉化細胞可達存活的原生質球總數的1%-5%。但是操作周期長（再生需4~6天），而且轉化效率受到原生質再生率的嚴重制約。酵母原生質轉化法一個顯著特點是，一個受體細胞可同時接納多個質粒分子，而且這種共轉化的原生質占轉化子總數的25%-33%。

酵母原生質體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）CaCl2使細胞壁具有通透性，允許DNA進入。轉化★第16頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（2）堿金屬離子介導的酵母菌轉化釀酒酵母經堿金屬離子（如Li+等）、PEG熱休克處理后，也可高效吸收質粒DNA，而且具有以下特性：吸收線性DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，二者相差80倍,共轉化現(xiàn)象較為罕見。（3）電轉化法酵母菌原生質體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質粒DNA，但在此過程中應避免使用PEG，它對受電擊的細胞具有較大的負作用。其優(yōu)勢在于不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉化率高達105轉化子/μgDNA。

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG4000★★第17頁,共26頁，2024年2月25日，星期天其他導入技術：接合轉移在質粒轉移過程中，利用供體細胞可與受體細胞發(fā)生接合作用而將質粒導入受體細胞的方法，供體細胞和受體細胞可以為不同微生物：例如大腸桿菌和鏈霉菌供體細胞含有輔助質粒，輔助質粒為可轉移的接合型質粒，含有與接合轉移有關的基因（tra），這類質粒一般也是廣宿主質粒。而重組質粒一般不含tra基因，但有bom基因，可以被誘動轉移；一般是穿梭載體，保證在供體菌（E.coli）和受體菌（例如根瘤菌或鏈霉菌）中均能復制。將含輔助質粒的細胞、含重組質粒的供體細胞與受體細胞三者共同培養(yǎng)，便可實現(xiàn)重組質粒導入受體細胞，稱為三親雜交接合轉移★第18頁,共26頁，2024年2月25日，星期天三親雜交接合轉移重組質粒從大腸桿菌轉移到土壤農桿菌★第19頁,共26頁，2024年2月25日，星期天葉盤消毒切取土壤農桿菌浸泡看護培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗3.導入植物細胞（1）葉盤法（leafdisk)★第20頁,共26頁，2024年2月25日，星期天植物細胞原生質體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25

F電擊愈傷組織幼苗分化（2）.電擊法（electroporation)☆第21頁,共26頁，2024年2月25日，星期天又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicroprojectiles)以冷壓縮氣體為動力將吸附DNA的金屬微粒打入細胞內，完成基因轉移，適合各種細胞（微生物、動植物）?？焖?、簡便、安全、高效。還可以導入細胞（如內生菌）、蛋白、細胞器、細胞核等。DNA1.2

m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入（3）.基因槍法（genegun）☆第22頁,共26頁，2024年2月25日，星期天原理（略）4.導入動物細胞（1）.磷酸鈣沉