第三章基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)第三章基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)11.簡述核酸酶：通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鍵發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。分為兩類：從核酸分子末端開始，一個(gè)核苷酸一個(gè)核苷酸地消化降解多核苷酸鏈的叫核酸外切酶（exonuclease）;從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔研纬尚∑?，叫做核酸?nèi)切酶（endonuclease）核糖核酸酶（RNase）：水解斷裂RNA分子脫氧核糖核酸酶：特異水解斷裂DNA分子核酸限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶是重組DNA技術(shù)賴以創(chuàng)立的酶學(xué)基礎(chǔ)1.簡述核酸酶：核酸限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶是重組DNA2DNA的堿基通過磷酸二酯鍵連接DNA的堿基通過磷酸二酯鍵連接3限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA連接酶—用于連接兩條DNA分子或片段反轉(zhuǎn)錄酶—以RNA分子為模板合成互補(bǔ)的cDNA鏈DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化多核苷酸激酶—將一個(gè)磷酸分子加到多核苷酸鏈的5’-OH末端堿性磷酸酶—催化從DNA分子的5’或3’端移去末端磷酸基團(tuán)核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。2.重組DNA實(shí)驗(yàn)中的工具酶及其運(yùn)用限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割2.重組DN4是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（Restrictionendonuclease）第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8b52.性質(zhì)：內(nèi)切酶原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。自我保護(hù)作用。3.功能：細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來源：2.性質(zhì)：內(nèi)切酶原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。61.1寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象在K株或B株上生長繁殖的噬菌體λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌株的成斑率為1，而感染新的寄主菌株的成斑率則分別為10-4和4

10-4λ（K）在感染B菌株后長出的稀有噬菌斑中的噬菌體再次感染B菌株則可以有效地生長兩種酶的配合：修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶核酸限制性內(nèi)切酶（R/M體系）1.1寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象在K株或B株上生長繁殖的噬菌7（1）限制

（Restriction）（2）修飾

（Modification）（1）限制

（Restriction）（2）修飾

（Modi81.2限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

1.

細(xì)菌限制修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)WernerArber于1962-1968年發(fā)現(xiàn)，1968年分離到I型限制酶。

2.限制酶HindII的發(fā)現(xiàn)H．O．Smith和Wilox于1970年首次從流感嗜血桿菌（H.influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離到HindII限制酶。

3.SV40限制圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制D.Nathans（1971年）用HindII繪制SV40的限制酶譜。

1.2限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)91.3核酸內(nèi)切酶的類型1.3核酸內(nèi)切酶的類型101.4I型和III型核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性I型和III型核酸限制性內(nèi)切酶一般是大型的多亞基蛋白復(fù)合物，既具有內(nèi)切酶的活性又具有甲基化酶的活性。I型核酸限制性內(nèi)切酶的特性輔助因子：Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）三種不同的亞基：特異性亞基：特異識別DNA序列修飾亞基：具有甲基化酶的活性限制亞基：具有核酸內(nèi)切酶活性切割方式：結(jié)合在識別位點(diǎn)以滾環(huán)形式沿著DNA分子轉(zhuǎn)位，而后從距識別位點(diǎn)5’一側(cè)數(shù)千堿基處隨機(jī)切割DNA分子。1.4I型和III型核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性I型和III11III型核酸限制性內(nèi)切酶的特性輔助因子：Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）兩種不同的亞基：M亞基：位點(diǎn)的識別與修飾R亞基：核酸酶的活性切割方式：反應(yīng)過程中會沿著DNA分子移動，并從距識別位點(diǎn)一側(cè)約25bp處單鏈切割DNA分子。其識別序列是特異而非對稱的。

III型核酸限制性內(nèi)切酶的特性輔助因子：121.4II型核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性II型只有一種多肽，通常以同源二聚體形式存在。1.在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位切割DNA分子產(chǎn)生鏈的斷裂；2.兩個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相對的；3.斷裂形成的DNA片段往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。識別序列：雙重旋轉(zhuǎn)對稱（回文結(jié)構(gòu)），未甲基化1.4II型核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性II型只有一種多肽，13

1.識別順序和酶切位點(diǎn)

１）識別４、6、8個(gè)相連的核苷酸

BamHI：HhaI：NotI：FokI：5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外側(cè)，產(chǎn)生５’-端突起IIs型BamHI：HhaI：NotI：FokI：5’-ＧＧＡ14

2）對稱性—雙對稱

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3）切點(diǎn)大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外4）限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.

末端種類（粘性末端、平末端）

１）３’-端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸

PstI

5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAOH

PG-3’3’-GACGTC-5’3’-GP

HOACGTC-5’

２）５’-端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸

EcoRI

5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’2）對稱性—雙對稱15３）

平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互補(bǔ)的粘性末端i）切點(diǎn)在識別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ii）能識別簡并順序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

３）

平齊末端16５）相容性末端如：BamHIGGATCCBglII

AGATCTMboI,Sau3AINGATCN

上述幾種限制酶產(chǎn)生的DNA片段仍可相連，由此形成的重組分子能被MboI和Sau3AI識別和酶切。

BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/A

BamHI和BglII(AGATCT)兩種酶產(chǎn)生的相容性末端，相連后不能為兩種酶所識別和酶切。

BamHI+BglIIA/GGATCT/C５）相容性末端173同裂酶（isoschizomers）定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶（產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端）用以研究DNA甲基化作用：一對同裂酶：HpaII和MspI，識別序列同為CCGG，當(dāng)靶序列中含一個(gè)5-甲基胞嘧啶（CC

GG）時(shí)，HpaII不能切割它而MspI則同樣能切開，因此可通過比較HpaII和MspI的DNA消化產(chǎn)物來檢測胞嘧啶的甲基化。3同裂酶（isoschizomers）定義：能識別相同序列18①完全同裂酶識別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’①完全同裂酶識別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。HindⅢ519XmaI5’-C

CCGGG-3’3’-GGGCC

C-5’SmaI5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’識別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶XmaI5’-CCCGGG-3’識別位點(diǎn)相204.同尾酶（isocaudamer）定義：來源不同,識別不同序列但產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶

5’-G

GATCC-3’3’-CCTAG

G-5’BamHIBclI5’-T

GATCA-3’3’-ACTAG

T-5’

5’-A

GATCT-3’3’-TCTAG

A-5’BglⅡ5’-U

GATCY-3’3’-YCTAG

U-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。4.同尾酶（isocaudamer）定義：來源不同,識別不215.限制片段末端的連接作用許多種限制酶切割DNA分子形成的短片段能夠自發(fā)地重新環(huán)化起來，用DNA連接酶處理能使它們的3’-OH和5’-P基團(tuán)封閉起來形成永久的環(huán)形DNA分子。兩種類型：DNA分子間和分子內(nèi)5.限制片段末端的連接作用許多種限制酶切割DNA分子形成22基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)23

1.5限制性內(nèi)切酶的命名命名原則：（1）用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語表示寄主菌的物種名稱；（2）用一個(gè)寫在右下方的標(biāo)注字母代表菌株或型；（3）幾個(gè)不同的限制與修飾體系以羅馬數(shù)字表示。

例如：HindⅢ前三個(gè)字母來自于菌種名稱H.

influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個(gè)限制酶。EcoRI—Escherichiacoli

RI

HindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)

241.6影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1.DNA的純度DNA中的污染組分如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高濃度的鹽離子都有可能抑制核酸限制性內(nèi)切酶的活性?？朔侄危?/p>

純化DNA增加酶的用量擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，使得潛在抑制因素被稀釋延長酶催化反應(yīng)的時(shí)間對于DNase的污染，可加入二價(jià)金屬離子螯合劑EDTA結(jié)合Mg2+。加入適量聚陽離子亞精胺有利于限制性內(nèi)切酶對基因組DNA的消化作用。1.6影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1.DNA的純度DNA中252.DNA的甲基化程度采用失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒使用對甲基化不敏感的酶3.酶切溫度大部分酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，但也有一些低于或高于此溫度，嚴(yán)格參照說明。4.DNA的分子結(jié)構(gòu)DNA分子的螺旋結(jié)構(gòu)、切割靶序列所處的位置對酶切速率有影響，一些酶對不同部位的限制位點(diǎn)的切割活性也有差異。2.DNA的甲基化程度采用失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備265.酶反應(yīng)的緩沖液緩沖液成分包括：MgCl2、NaCl或KCl、Tris-HCl、β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。各種酶對以上成分的濃度要求都有所差異，若某些酶的敏感因子濃度改變較大可能造成酶的非特異切割。酶的星號（*）活性：在非最適條件下，限制性內(nèi)切酶會在與其識別序列類似但并不相同的DNA序列上切割。

MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；5.酶反應(yīng)的緩沖液緩沖液成分包括：MgCl2、NaCl或K27表1具有星反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶與條件限制酶誘發(fā)星活性的條件a識別序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1：亞乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基亞砜(8%);8:無NaCl。

表1具有星反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶與條件281.7限制性內(nèi)切酶在實(shí)驗(yàn)中的使用當(dāng)建立內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系時(shí)有幾個(gè)關(guān)鍵因素需要考慮。比如如何在正確的反應(yīng)體系中，加入適量的DNA、內(nèi)切酶和緩沖液，就可以獲得最佳酶切效果。在50μl體系中，最適反應(yīng)條件下，1單位（U）的限制性內(nèi)切酶可以在60分鐘內(nèi)完全切割1μg的底物DNA。

大多數(shù)科研人員會遵循右表中所列的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件，使用5－10倍的過量酶切割DNA，這樣有利于克服由于DNA來源不同、質(zhì)量和純度不同而造成的實(shí)驗(yàn)失敗“標(biāo)準(zhǔn)”反應(yīng)體系

1.7限制性內(nèi)切酶在實(shí)驗(yàn)中的使用當(dāng)建立內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系時(shí)29?酶從冰箱取出后請一直置于冰上。?酶最后加入到反應(yīng)體系中。?加入酶之后將反應(yīng)混合物混勻，可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁，然后在離心機(jī)中快速離心。?當(dāng)切割超螺旋質(zhì)粒和瓊脂糖包埋DNA時(shí)，通常需要超過1unit/μg的酶量以達(dá)到完全酶切。實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)?建議在50μl反應(yīng)體系中消化1μg底物DNA。?為避免星號活性，甘油濃度應(yīng)<5%。?加入內(nèi)切酶（貯存于50%甘油中）的量應(yīng)不超過總體積的10%。?大多數(shù)內(nèi)切酶建議保存在-20℃。只有少數(shù)內(nèi)切酶若貯存時(shí)間超過30天建議保存在-70℃。?酶從冰箱取出后請一直置于冰上。實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)?建議在30雙酶切同步雙酶切是一種省時(shí)省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時(shí)作用的最佳緩沖液并避免星號活性是非常重要的一步。

分步酶切應(yīng)從推薦緩沖液鹽濃度低的酶開始，溫育至酶切完畢。調(diào)整緩沖液中鹽濃度（用小體積濃縮鹽溶液）直至滿足第二種酶的要求。加入第二種酶完成雙酶切反應(yīng)。也可在第二步酶切反應(yīng)前過柱純化DNA。

雙酶切同步雙酶切是一種省時(shí)省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同31雙酶切時(shí)應(yīng)注意：對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATG

GATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAG

GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC

GGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGG

CCCAAGCGTA…5’BamHISmaI雙酶切時(shí)應(yīng)注意：對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，32第二節(jié)DNA連接酶體外連接DNA片段的方法：用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段用T4DNA連接酶直接將平末端DNA片段連接起來，或用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端DNA加上poly(dA)-poly(dT)尾巴后再用DNA連接酶連接先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端后，再用DNA連接酶連接第二節(jié)DNA連接酶體外連接DNA片段的方法：33DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。DNA復(fù)制一定有斷口。DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)從細(xì)菌D34（1）DNA連接酶（大腸桿菌）1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。二、DNAligase的特點(diǎn)（2）T4DNA連接酶（噬菌體）不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。（1）DNA連接酶（大腸桿菌）1.兩種DNA連接酶只能連接35（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-O36不能連接兩條單鏈DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA必須是雙螺旋DNA分子的一部分nickgap不能連接兩條單鏈DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的D37DNA連接的分子機(jī)理DNA連接的分子機(jī)理38連接反應(yīng)的影響因素

1.連接緩沖液的影響：合適酸堿度，pH的范圍在7.4-7.8，較多用7.8；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應(yīng)；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L，作用是維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。2.ATP濃度的影響：連接緩沖液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，過濃會抑制反應(yīng)。由于ATP極易分解，含有ATP的緩沖液應(yīng)于-20℃保存，溶化取用后立即放回。最好小管分裝貯存，防止反復(fù)凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長期保存），臨用時(shí)加入新配制的ATP母液。

連接反應(yīng)的影響因素1.連接緩沖液的影響：合適酸堿度，pH394、連接溫度與時(shí)間的影響：連接酶的最適溫度為37℃，但因?yàn)轲ば阅┒说腄NA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會使氫鍵不穩(wěn)定，為了解決這一矛盾，在經(jīng)過綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16-20℃，時(shí)間為4-16h。對于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。

5、載體與插入片段的量適當(dāng)?shù)妮d體與片段的摩爾比能提高連接效率，并減少多拷貝插入片段的的形成，一般：載體插入片段=13-104、連接溫度與時(shí)間的影響：連接酶的最適溫度為37℃，但因?yàn)轲?02.粘性末端DNA的連接DNA片段與載體用同一種內(nèi)切酶酶切后，利用DNA連接酶將酶切形成的粘性末端連接起來單酶切時(shí)如何阻止載體的自我環(huán)化？實(shí)驗(yàn)中普遍采用片段和載體用不同的酶雙酶切形成不同的粘性末端，這種操作具有方向性2.粘性末端DNA的連接DNA片段與載體用同一種內(nèi)切酶酶切41基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)423.平末端DNA的連接直接用T4DNA連接酶（需要ATP、高濃度酶和底物）（1）同聚物加尾法3.平末端DNA的連接直接用T4DNA連接酶（需要ATP43（2）銜接物連接法（2）銜接物連接法44雙銜接物連接法雙銜接物連接法45（3）DNA接頭連接法（3）DNA接頭連接法464.熱穩(wěn)定DNA連接酶寡核苷酸連接測定（OLA）4.熱穩(wěn)定DNA連接酶寡核苷酸連接測定（OLA）47練習(xí)題練習(xí)題48DNA片段表達(dá)載體（兩側(cè)具有BamHI酶切位點(diǎn)）BamHI酶切BamHI酶切堿性磷酸酶處理DNA連接酶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞涂布具有抗生素的平板培養(yǎng)基上實(shí)驗(yàn)設(shè)置了四個(gè)對照：1.將未同任何載體接觸的感受態(tài)細(xì)菌涂布在平板上2.將未酶切載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌涂布在平板上3.將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（無DNA片段）的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂布在平板上4.將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（無DNA片段）的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂布在平板上DNA片段表達(dá)載體（兩側(cè)具有BamHI酶切位點(diǎn)）BamH49實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一次實(shí)驗(yàn)：感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計(jì)數(shù)的菌落第二次實(shí)驗(yàn)：自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這次所有的平板都沒有菌落生長第三次實(shí)驗(yàn)：這次長出了正常數(shù)量的細(xì)菌，挑了12個(gè)菌落，分離了質(zhì)粒DNA，用BamHI進(jìn)行酶切，其中9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一條帶，其它3個(gè)則切出了與插入DNA大小一致的片段。TMTC：toomanytocount實(shí)驗(yàn)結(jié)果：TMTC：50答案：答案：51第三節(jié)DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T4DNA聚合酶4.T7DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.TaqDNA聚合酶7.逆轉(zhuǎn)錄酶第三節(jié)DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿521.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。1.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.53DNA聚合酶3’

5’外切酶活性5’

3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶I低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率541.DNA聚合酶I在50年代的中期，A.Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ）原來稱為Kornberg酶。以后又相續(xù)發(fā)現(xiàn)了DNApolⅡ和DNApolⅢ。DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3'

－OH；（3）合成的方向都是5'→3'；（4）除聚合DNA外還有其它功能。

岡崎片段1.DNA聚合酶I在50年代的中期，A.Kornberg551.DNA聚合酶I（polI）三種酶催活性：5’-3’聚合酶活性5’-3’核酸外切酶活性3’-5’核酸外切酶活性polI催化合成DNA的三種條件：（1）存在四種dNTPs和Mg2+（2）帶有3’-OH游離基團(tuán)的引物鏈（3）DNA模板（雙鏈或單鏈）鏈合成方向：5’3’1.DNA聚合酶I（polI）三種酶催活性：polI催化合成56polI的5’3’聚合作用polI的5’3’聚合作用57polI的5’3’核酸外切酶活性（切除修復(fù)）必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；切割部位既可以是末端也可以是距末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的磷酸二酯鍵；伴隨發(fā)生的DNA合成可以增強(qiáng)5’-3’外切酶的活性；對雙鏈DNA的單鏈缺口有活性但要存在5’-P基團(tuán)。用枯草桿菌蛋白酶切割成兩個(gè)片段，一個(gè)片段36kDa具有5’-3’外切酶的活性;另一片段76kDa具有聚合酶活性及3’-5’外切酶活性，此即為Klenow片段。polI的5’3’核酸外切酶活性（切除修復(fù)）必須是58polI的3’5’核酸外切酶活性（校正）從DNA鏈3’-OH末端開始水解DNA并釋放單核苷酸分子，底物可以是雙鏈的DNA也可以是單鏈的DNA。當(dāng)反應(yīng)物中缺乏dNTPs時(shí)，3’-5’外切酶活性將從3’-OH開始降解DNA。但在具有dNTPs的條件下，這種降解活性會被5’-3’的聚合酶活性所抑制。polI的3’5’核酸外切酶活性（校正）從DNA59DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備放射性標(biāo)記的DNA探針PolI、DNaseI、32P-dNTPs、未標(biāo)記的dNTPsDNA缺口轉(zhuǎn)移，制備放射性標(biāo)記的DNA探針PolI、DNas602.DNA聚合酶I的Klenow片段具有5’-3’聚合酶活性、3’-5’外切酶活性用途：（1）修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端；（2）標(biāo)記DNA片段的末端；（3）cDNA克隆中的第二鏈cDNA的合成；（4）DNA序列測定2.DNA聚合酶I的Klenow片段具有5’-3’聚合酶活613’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種

-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA限制性內(nèi)切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI

-32P-dATP

-32P-dGTP25oC1h3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補(bǔ)平根623.T4DNA聚合酶兩種酶催活性：5’-3’聚合酶及3’-5’外切酶其3’外切酶活性可作用于所有3’-OH末端基團(tuán)，不管其是平末端還是粘末端用來標(biāo)記DNA平末端或隱蔽的3’-末端3.T4DNA聚合酶兩種酶催活性：用來標(biāo)記DNA平末端或634.TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是從一種水生棲熱菌（Thermusaquaticus）yT1株分離提取的。Taq酶的特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時(shí)不會被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。70℃延伸率大于60個(gè)核苷酸/秒

4.TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是從一種水生棲64TaqDNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，而無3’→5’外切活性，因而，在PCR反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯(cuò)配，該酶沒有校正功能的，30次循環(huán)Taq酶的錯(cuò)配率約為0.25％應(yīng)用低濃度的dNTP(各20μmol／L)、1.5mmol/L的Mg2+濃度、高于55℃的復(fù)性溫度，可提高Taq酶的忠實(shí)性.

Taq酶的性質(zhì)TaqDNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切65Taq酶的性質(zhì)Taq酶具有類似于末端轉(zhuǎn)移酶的TdT的活性，可在新生成的雙鏈產(chǎn)物的3’端加上—個(gè)堿基，尤其是dATP最容易加上。用于TA克隆Taq酶還具有反轉(zhuǎn)錄活性。在2-3mmol/L

Mg2+濃度下68℃時(shí)出現(xiàn)類似反轉(zhuǎn)錄酶的活性。若有Mg2+存在，則反轉(zhuǎn)錄活性更佳，利用這一活性，可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的擴(kuò)增。Taq酶的性質(zhì)Taq酶具有類似于末端轉(zhuǎn)移酶的TdT的活性，66Taq酶的選擇高特異性Taq酶最典型的代表是熱啟動Taq酶如何減少引物和模板的非特異性配對？第一代熱啟動Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修飾，比如用抗體抑制，蠟封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些產(chǎn)品。新一代的熱啟動Taq酶是通過內(nèi)部改造的重組酶，真正實(shí)現(xiàn)便利的熱啟動，代表產(chǎn)品如QIAGEN公司的HotStar系列熱啟動的Taq酶也是實(shí)現(xiàn)一步法RT-PCR的基礎(chǔ)特異性、保真性、耐熱性、擴(kuò)增速率、擴(kuò)增片段長度、能否進(jìn)行復(fù)雜模板擴(kuò)增等Taq酶的選擇高特異性Taq酶最典型的代表是熱啟動Taq67高保真Taq酶經(jīng)基因工程改造，具有3’-5’外切酶活性（校驗(yàn)功能）擴(kuò)增效率降低，不宜用于TA克隆如Stratagene的Pfu，NEB公司的VentDNA聚合酶，QIAGEN公司新推出的ProofStartDNA聚合酶，兼特異性與保真性于一體。高耐熱性Taq酶

NEB公司的Vent和DeepVentDNA聚合酶系列，兩者都是從海底火山口分離出來后克隆的，是普通Taq酶耐熱性的三倍以上，前者在95°C半衰期近7小時(shí)，100°C近2小時(shí)；后者更甚，分別為23小時(shí)和8小時(shí)。高保真Taq酶經(jīng)基因工程改造，具有3’-5’外切酶活性68超長片段擴(kuò)增Taq酶

對于作基因組圖譜、測序及分子遺傳學(xué)研究的用戶，可能會用到超長片段的擴(kuò)增，Clontech公司的AdvantageGenomic系列混有TthDNA聚合酶，Proofreading酶和熱啟動抗體，對復(fù)雜模板可擴(kuò)增10kb片段，簡單模板可達(dá)40kb。超長片段擴(kuò)增Taq酶對于作基因組圖譜、測序及分子遺傳學(xué)研究695.逆轉(zhuǎn)錄酶（1）AMV（禽類成髓細(xì)胞瘤病毒）反轉(zhuǎn)錄酶

α肽鏈：具有反轉(zhuǎn)錄酶與RNaseH活性（RNaseH：核糖核酸外切酶，以5’-3’或3’-5’方向特異地降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈）

β肽鏈：5’-3’脫氧核酸外切酶

（以RNA-DNA雜交分子為底物）依賴于RNA的DNA聚合酶5.逆轉(zhuǎn)錄酶（1）AMV（禽類成髓細(xì)胞瘤病毒）反轉(zhuǎn)錄酶70（2）M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒

）反轉(zhuǎn)錄酶

1)特點(diǎn)：

無3’-5’外切酶活性;RNaseH活性低;穩(wěn)定性差；37℃最適

2)與AMV反轉(zhuǎn)錄酶比較a．合成短鏈cDNA(0.6kb)時(shí)，兩者相同，但M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶需要量大，可能與其穩(wěn)定性差有關(guān)b．合成長鏈cDNA(4.5-7.5kb)時(shí)，它比AMV反轉(zhuǎn)錄酶有效得多。c.AMV延伸溫度可達(dá)50℃，因此對模板次級結(jié)構(gòu)較為耐受3)用途a.cDNA合成用于文庫建立;b.制備cDNA探針;c.DNA序列分析;

（2）M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）反轉(zhuǎn)錄酶71第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1.來源小牛胸腺。2.組成大小兩個(gè)亞基。3.特性5’

3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1.來源小72②不需要模板?、傩枰?’—OH、二甲胂酸緩沖液。③底物可以是單鏈DNA、3’—OH突出的雙鏈DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④隨機(jī)添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端轉(zhuǎn)移酶②不需要模板?、傩枰?’—OH、二甲胂酸緩沖液。③底物734.末端轉(zhuǎn)移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。外源DNA載體DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉(zhuǎn)移酶4.末端轉(zhuǎn)移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體74（2）再生酶切位點(diǎn)便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow補(bǔ)平（2）再生酶切位點(diǎn)便于回收克隆片斷。AAGCTT5’5’Hi75AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶dTTPAAAAAA外源DNAAAGCTAGCTTAAGCTTTTAGC76AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位點(diǎn)HindⅢ位點(diǎn)連接AAGCTTTTAGCTTAAAAAAHi77二、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細(xì)菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。二、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。782.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO-