第1章

發(fā)酵工程1.2

微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用

第2課時(shí)

微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)12闡明微生物選擇培養(yǎng)的原理進(jìn)行土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)學(xué)習(xí)目標(biāo)問題探討

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫的DNA聚合酶。1973年，科學(xué)家從美國(guó)黃石國(guó)家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進(jìn)而提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。思考：為什么水生棲熱菌能從熱泉中篩選出來呢？這是因?yàn)樗鷹珶峋茉?0-80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。一、選擇培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)室篩選微生物原理：人為提供

的條件（包括_____、_____和_____等），同時(shí)

。

有利于目的菌生長(zhǎng)抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)溫度pH方法：利用選擇培養(yǎng)基分離

選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，允許特別種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)

抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。思考·討論：怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌?一、選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有抗氨芐青霉素能力的菌落長(zhǎng)出各種各樣的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基+氨芐青霉素

沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌?基礎(chǔ)培養(yǎng)基怎么證明一個(gè)選擇培養(yǎng)基具有選擇性呢？

應(yīng)設(shè)置基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）作為對(duì)照，若基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落數(shù)多于該選擇培養(yǎng)基，則說明該選擇培養(yǎng)基具有選擇性。選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會(huì)被土壤中的某些細(xì)菌分解成NH3，再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?，脲酶催化尿素分解產(chǎn)生NH3，NH3可以作為細(xì)菌生長(zhǎng)的氮源。討論：1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來，培養(yǎng)

基的配方該如何設(shè)計(jì)？設(shè)計(jì)一種選擇培養(yǎng)基，以尿素作為唯一氮源。(細(xì)菌生長(zhǎng)的氮源)尿素NH3脲酶尿素分解菌尿素2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？

除以尿素作為唯一氮源外，該培養(yǎng)基的其他營(yíng)養(yǎng)成分與普通培養(yǎng)基基本相同。二、微生物的選擇培養(yǎng)1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌？分離：獲得分解尿素的細(xì)菌的純培養(yǎng)物計(jì)數(shù)：測(cè)定分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量用平板劃線法接種培養(yǎng)結(jié)果的圖片如下。請(qǐng)結(jié)合圖片分析，平板劃線法能否達(dá)到對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)的目的？為什么？

不能，平板劃線法最開始的劃線很可能菌類會(huì)長(zhǎng)成一片，導(dǎo)致無法計(jì)數(shù)，此外灼燒接種環(huán)的時(shí)候也會(huì)殺死一部分菌類。二、微生物的選擇培養(yǎng)

稀釋涂布平板法1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL無菌水90mL無菌水10g將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。

系列稀釋二、微生物的選擇培養(yǎng)

稀釋涂布平板法微量移液器

涂布平板③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表

面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。二、微生物的選擇培養(yǎng)

稀釋涂布平板法

培養(yǎng)待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置（同時(shí)放一個(gè)未接種的培養(yǎng)基），放入30~37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2d。恒溫培養(yǎng)箱稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對(duì)照二、微生物的選擇培養(yǎng)二、微生物的選擇培養(yǎng)比較平板劃線法稀釋涂布平板法工具接種環(huán)涂布器操作接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線系列梯度稀釋操作和涂布平板操作特點(diǎn)方法簡(jiǎn)單，但不適宜計(jì)數(shù)單菌落更易分開，可以計(jì)數(shù)，但操作復(fù)雜，需涂布多個(gè)平板結(jié)果共同點(diǎn)常用微生物分離方法比較都能將微生物分散到固體培養(yǎng)基表面，以獲得單細(xì)胞菌落，達(dá)到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征三、微生物的數(shù)量測(cè)定②計(jì)數(shù)原則：缺點(diǎn)：

統(tǒng)計(jì)的_________往往比______的實(shí)際數(shù)目少①原理：【原因：當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落?！?/p>

方法1：稀釋涂布平板法當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)______。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少______。選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)為_______、適于計(jì)數(shù)的平板。在同一稀釋度下，應(yīng)至少對(duì)___個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出_______?；罹罹?0～300平均值3菌落數(shù)活菌間接計(jì)數(shù)法三、微生物的數(shù)量測(cè)定M：代表稀釋倍數(shù)；C：代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)；V：代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)間接計(jì)數(shù)法4號(hào)試管的結(jié)果表明每克土壤中的活菌數(shù)約為________個(gè)

方法1：稀釋涂布平板法③計(jì)算公式：每g樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M1.1×108三、微生物的數(shù)量測(cè)定快速、直觀

方法2：顯微鏡直接計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法兩者計(jì)數(shù)原理相同原理：利用細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：

不能區(qū)分死菌與活菌對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)常用于相對(duì)較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子等的計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板思考:為了避免上述缺點(diǎn)，我們?cè)撊绾巫觯靠梢匀旧ㄈ缡褂门_(tái)盼藍(lán)，死細(xì)胞會(huì)被染成藍(lán)色）后再進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)。三、微生物的數(shù)量測(cè)定項(xiàng)目顯微鏡直接計(jì)數(shù)法稀釋涂布平板法主要用具顯微鏡、_____________

等培養(yǎng)基等計(jì)數(shù)依據(jù)菌株本身培養(yǎng)基上的

數(shù)優(yōu)點(diǎn)計(jì)數(shù)方便、操作簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)的都是活菌缺點(diǎn)死菌、活菌都計(jì)數(shù)在內(nèi)操作復(fù)雜、有一定誤差血細(xì)胞計(jì)數(shù)板或細(xì)菌計(jì)數(shù)板菌落一邊閱讀，一邊完成學(xué)案上的表格比較稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

細(xì)菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長(zhǎng)，絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。操作步驟1.土壤取樣取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。注意

探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)

不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計(jì)數(shù)的平板。

探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)測(cè)細(xì)菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液。2.樣品的稀釋與涂布平板思考：在初次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證

從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？

選擇一個(gè)比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分

別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300

的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)選擇培養(yǎng)基（平行重復(fù)）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(作為對(duì)照)2.樣品的稀釋與涂布平板

探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)3.培養(yǎng)與觀察恒溫培養(yǎng)箱待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30-37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1-2d。

探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)內(nèi)容現(xiàn)象結(jié)論有無雜菌污染的判斷對(duì)照的培養(yǎng)皿中無菌落生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中菌落數(shù)偏高選擇培養(yǎng)基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目未被雜菌污染被雜菌污染選擇培養(yǎng)基具有篩選作用問題1：你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30～300的平板？4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)問題2：你統(tǒng)計(jì)的每克土樣中能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)與其他同學(xué)統(tǒng)計(jì)的

結(jié)果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？如果得到了兩個(gè)或多個(gè)菌落數(shù)為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。如果是用同一土樣進(jìn)行的操作，數(shù)據(jù)應(yīng)該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基配制是否合理等方面查找原因。

探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)5.進(jìn)一步探究得到的菌落一定是分解尿素的細(xì)菌嗎？不一定，還需要進(jìn)一步的鑒定混合樣品得到的菌落不一定就是分解尿素的細(xì)菌，如自生固氮菌或利用（分解尿素的）細(xì)菌的代謝物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的微生物

探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)5.進(jìn)一步探究在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→酚紅變紅酚紅培養(yǎng)基——鑒定分解尿素的細(xì)菌脲酶CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3

探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品(不影響微生物正常生長(zhǎng))，使微生物的某種代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中的特定指示劑或化學(xué)藥品發(fā)生反應(yīng)。從而達(dá)到鑒定目標(biāo)微生物的作用。伊紅-亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌（若有，菌落呈深紫色，有金屬光澤）剛果紅培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌補(bǔ)充資料-培養(yǎng)基的類型及用途）劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途物理性質(zhì)化學(xué)成分用途不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類鑒定微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基成分明確分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng),促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)、分離出特定微生物在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基課堂小結(jié)微生物的