專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)了解有關(guān)微生物及培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí)，進(jìn)行無菌技術(shù)的操作，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。

一、課題目標(biāo)：掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點(diǎn)和難點(diǎn)：三、技能目標(biāo)：課題背景微生物研究和應(yīng)用的前提：如何獲得純凈培養(yǎng)物？防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物①提供合適的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件②確保其他微生物無法混入一、培養(yǎng)基作用、種類二、無菌技術(shù)三、制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基四、純化大腸桿菌主要內(nèi)容一基礎(chǔ)知識(shí)1.概念：

人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。2.類型：按物理性質(zhì)劃分：按化學(xué)成分劃分：按用途劃分：（一）培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有

無凝固劑瓊脂分離鑒定工業(yè)生產(chǎn)（1）按物理性質(zhì)劃分：天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基:（2）按化學(xué)成分劃分：按照需要的成分進(jìn)行配置。（3）按用途劃分：選擇培養(yǎng)基:鑒別培養(yǎng)基:加入某種化學(xué)物質(zhì)，從眾多微生物中分離出所需微生物。加入某種試劑，鑒別不同種類的微生物。加入青霉素的培養(yǎng)基:不加氮源的無氮培養(yǎng)基:不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:幾種選擇培養(yǎng)基舉例：分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物唯一碳源為纖維素的培養(yǎng)基分解纖維素的細(xì)菌3.基本成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽⑴碳源無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含C、H、O、N的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源（二）無菌技術(shù)防止外來雜菌的污染.1.哪里需要無菌？2.如何控制無菌？無菌的意義：（1）實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。（2）培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。（3）為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。（4）實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

1.無菌的范圍消毒:2、無菌技術(shù)的種類滅菌:

使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來殺死部分對(duì)人體有害的微生物。使用較為強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）?！挎撸涸谀承┘?xì)菌生長(zhǎng)的一定階段，細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形、橢圓形或柱形的，抗逆性強(qiáng)的休眠體?！咦樱赫婢a(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的細(xì)胞，能直接發(fā)育成新個(gè)體。接種室內(nèi)空氣、接種箱、超凈工作臺(tái)用紫外線照射30min紫外線消毒實(shí)驗(yàn)者的手臂、實(shí)驗(yàn)臺(tái)等酒精、氯氣、石炭酸、煤酚皂溶液化學(xué)藥劑消毒牛奶等不宜高溫消毒滅菌的70～75℃,30min；80℃,15min巴氏消毒日常食物、罐裝食品100℃,5～6min煮沸消毒法適用范圍條件方法（1）消毒15～30min100kPa，121℃培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器材高壓蒸汽滅菌1～2h干熱滅菌箱（160℃～170℃）耐高溫需干燥的物品（玻璃器皿等）干熱滅菌燒紅酒精燈火焰充分燃燒層灼燒接種的工具、試管口、瓶口灼燒滅菌滅菌時(shí)間所需條件適用對(duì)象滅菌方法灼燒滅菌干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋（2）滅菌請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手思考?大腸桿菌的純化培養(yǎng)：（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基二實(shí)驗(yàn)操作（二）純化大腸桿菌1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g1.計(jì)算：培養(yǎng)基用量依配方計(jì)算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂、攪拌→補(bǔ)水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：加棉塞、包牛皮紙、橡皮筋勒緊（一）制備培養(yǎng)基培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌，培養(yǎng)皿干熱滅菌閱讀課本P17，思考與討論倒平板操作后面的四個(gè)問題。計(jì)算

稱量

溶化

調(diào)節(jié)pH

滅菌

倒平板（一）制備培養(yǎng)基1.將培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手撥出棉塞。12342.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。3.用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10～20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上皿蓋。4.等待平板冷卻凝固（約需5～

10min）。然后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：①防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染②避免培養(yǎng)基中水分過快蒸發(fā)。答：最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。防止空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24～48小時(shí)，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。5.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？單個(gè)或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：菌

落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體單個(gè)細(xì)胞單個(gè)菌落（二）純化大腸桿菌從混雜的微生物群體中獲得只含某一種微生物的過程。何為分離純化？如何純化？接種常見方法平板劃線法操作核心防止雜菌污染，保持培養(yǎng)物純度如何分散成單個(gè)細(xì)胞？稀釋涂布平板法斜面接種穿刺接種微生物群分散1.平板劃線法：分區(qū)劃線法連續(xù)劃線法（1）概念與原理：聚集的菌群連續(xù)劃線稀釋分散單個(gè)細(xì)胞菌落生長(zhǎng)繁殖1.灼燒接種環(huán)，直至將接種環(huán)_______2.在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞3.試管口通過火焰.4.將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液6.將皿蓋打開一條縫隙，將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。5.試管通過火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五7.灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四區(qū)域內(nèi)劃線。末端燒紅8.將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)（1）為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí),仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？問題討論殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者接種結(jié)束后殺死上次劃線時(shí)殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時(shí)菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個(gè)細(xì)胞每次劃線前殺死接種環(huán)上原有微生物取菌種前目的灼燒時(shí)期（2）在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？

答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。（3）在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。3個(gè)劃線平板1個(gè)不劃線平板（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（空白對(duì)照）（3）培養(yǎng)放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h2.稀釋涂布平板法①菌液的梯度稀釋：②涂布平板操作：(1)概念與原理：聚集的微生物單個(gè)細(xì)胞菌液梯度稀釋菌落涂布平板(2)操作：生長(zhǎng)繁殖①系列梯度稀釋操作9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水注意：移液管需要經(jīng)過滅菌；試管口和移液管離火焰1～2cm處。②涂布平板操作：(1)涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？答：應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如:①酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適②吸管頭不要接觸任何其他物體③吸管要在酒精燈火焰周圍等等問題討論各梯度分別涂布3個(gè)平板1個(gè)不涂布作空白對(duì)照稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h（3）培養(yǎng)1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)？如果有菌落生長(zhǎng)，說明了什么？

未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨(dú)立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？

如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同嗎？如果不同，請(qǐng)分析產(chǎn)生差異的原因？

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、菌落的不斷生長(zhǎng)，使菌落不斷增大。4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請(qǐng)分析其可能的原因。

無菌操作未達(dá)到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時(shí)發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過程中受到了污染。1.臨時(shí)保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長(zhǎng)期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃四菌種的保存3～6個(gè)月，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)練習(xí)1.不能作為異養(yǎng)微生物碳源的是（）A．牛肉膏B．含碳有機(jī)物C．石油D．含碳無機(jī)物D2.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的主要差別是（）

A．碳源B．氮源

C．無機(jī)鹽D．生長(zhǎng)因子A

3.通過選擇培養(yǎng)基可以從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物。在碳源為纖維素的培養(yǎng)基上，大部分微生物無法生長(zhǎng)；在培養(yǎng)基中加入青霉素，可以抑制細(xì)菌和放線菌。利用上述方法能從混雜的微生物群體中分別分離出（）①大腸桿菌②霉菌③放線菌④纖維素分解菌

A.④②

B.①②

C.①③

D.③④

解析：選A。本題考查了微生物分離知識(shí)。纖維素分解菌可以利用纖維素，大部分微生物卻不能；培養(yǎng)基中加入青霉素可以抑制細(xì)菌和放線菌，但霉菌能夠生長(zhǎng)。習(xí)題鞏固1.獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是

A、將用于微生物培養(yǎng)的器皿.接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌

B、接種純種細(xì)菌

C、適宜環(huán)境條件下培養(yǎng)

D、防止外來雜菌的入侵2.下列操作與無菌技術(shù)無關(guān)的是

A、接種前用肥皂洗雙手,再用酒精擦拭雙手

B、接種前用火焰燒灼接種針

C、培養(yǎng)在50℃左右時(shí)擱置斜面

D、在酒精燈的火焰旁完成3.外科手術(shù)器械和罐頭食品的處理,要以能夠殺死什么為標(biāo)準(zhǔn)

A、球菌B、桿菌C、螺旋菌D、芽孢DCD編號(hào)成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml4．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請(qǐng)據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類是

。（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基，可再加入

，用于培養(yǎng)

，

自養(yǎng)型微生物

含碳有機(jī)物

金黃色葡萄球菌

（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)

。（4）表中營(yíng)養(yǎng)成分共有

類。（5）不論何