關(guān)于單核苷酸多態(tài)性及其應(yīng)用SNP的概念

單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)

是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。

同一物種不同個(gè)體間染色體上遺傳密碼單個(gè)堿基的變化，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性。第2頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天Singlenucleotidepolymorphism第3頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的特征

SNP是人類可遺傳的變異中最常出現(xiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，在人類基因組中廣泛存在，人類DNA中每300-1000bp就有一個(gè)SNP.

因此，一個(gè)人類個(gè)體大約攜帶300萬(wàn)-1000萬(wàn)個(gè)SNPs。第4頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的特征

一個(gè)SNP表示在基因組某個(gè)位點(diǎn)上一個(gè)核苷酸的變化，作為一種堿基的替換，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換（C—T，G—A），也可能是顛換。具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占SNP總量的2／3左右。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，而且在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，多是發(fā)生C—T的轉(zhuǎn)換，原因是CG中的C是甲基化的，它能自發(fā)的脫氨基而替換為胸腺嘧啶。第5頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP大都表現(xiàn)為二等位基因（bialletic)多態(tài)性,即在該位置只存在兩種不同的堿基。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)被稱作單倍型(haplotype)，相鄰SNPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個(gè)整體遺傳給后代.第6頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第7頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)SNP在基因組中的分布位置可分為:

基因編碼區(qū)SNP(cSNP)

基因調(diào)控區(qū)SNP(pSNP)

基因間隨機(jī)編碼區(qū)SNP(rSNP)

等三類。

因?yàn)榫幋a區(qū)內(nèi)的變異率占周圍序列的1/5，cRNP的總量顯著少于其他兩類SNPs。第8頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

cSNP又可分為2種：同義cSNP(synonymouscSNP)：非同義cSNP(non-synonymouscSNP)第9頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天同義cSNP：

SNP所導(dǎo)致的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；非同義cSNP：指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)的功能。這種改變常常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。位于基因調(diào)控區(qū)的SNP則會(huì)影響基因表達(dá)量的多少，因此，這兩類SNP在功能和疾病發(fā)生發(fā)展方面具有更重要的意義。第10頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的檢測(cè)方法

單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)

原理：?jiǎn)捂淒NA的折疊結(jié)構(gòu)是由單核苷酸序列決定的，當(dāng)某一個(gè)堿基發(fā)生突變時(shí)，便會(huì)直接影響該鏈的構(gòu)象，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移率會(huì)發(fā)生改變。第11頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的檢測(cè)方法變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)

原理:

當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性溫度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。第12頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的檢測(cè)方法

Taqman法

以熒光共振能量傳遞(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。在PCR反應(yīng)中，將供者-受者染料對(duì)分別結(jié)合到Taqman探針的兩端，探針未與目標(biāo)序列結(jié)合時(shí)，通過(guò)FRET作用使供者不發(fā)熒光；完全互補(bǔ)配對(duì)后，由于TaqDNA聚合酶具有5‘核酸酶的活性，可將供者從探針上切下來(lái)從而發(fā)出熒光。如果探針與目標(biāo)序列中存在錯(cuò)配堿基，就會(huì)減少探針與目標(biāo)序列結(jié)合的緊密程度及TaqDNA聚合酶切割供者的活性，也就影響了供者的熒光釋放量，從而使堿基突變鏈和正常鏈得以區(qū)分。第13頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

供者受者5‘

3‘

Taqman探針第14頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

供者受者5‘

3‘

Taqman探針第15頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

供者受者5‘

3‘

引物目標(biāo)序列第16頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天受者5‘

3‘

引物

供者目標(biāo)序列第17頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的檢測(cè)方法

分子信標(biāo)(molecularbeacon)法

分子信標(biāo)是一個(gè)U型的單鏈核苷酸探針（探針序列內(nèi)部可有一定程度的互補(bǔ)配對(duì)），在探針兩端也加上供者-受者染料對(duì)，U型探針使兩染料靠近，通過(guò)FRET作用使供者不發(fā)熒光。當(dāng)探針與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)配對(duì)后，兩染料分離，使得供者的熒光亮增加，如果目標(biāo)序列中存在錯(cuò)配堿基，就會(huì)影響探針與其結(jié)合，從而影響到供者的熒光亮，使堿基突變鏈和正常鏈得以區(qū)分。第18頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天供者受者第19頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

供者受者第20頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天焦磷酸測(cè)序法焦磷酸測(cè)序法(pyrosequencing)是一種不依賴平板膠或毛細(xì)管電泳，不依賴DNA的熒光標(biāo)記/激發(fā)/檢測(cè)體系的序列分析技術(shù)，適用于已知序列的DNA片段進(jìn)行驗(yàn)證分析，適用于已知SNP的序列驗(yàn)證及基因分型。第21頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

焦磷酸測(cè)序法主要是由四種酶催化同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng):

包括DNA聚合酶、硫酸化酶、螢光素酶和雙磷酸酶;

反應(yīng)底物為adenosine5‘phosphosulfate(APS)和螢光素。反應(yīng)體系還包括待測(cè)序的DNA單鏈和測(cè)序引物。第22頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，加入一種dNTP。如該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以催化該dNTP摻入到引物鏈中并釋放焦磷酸基團(tuán)(PPi)。摻入的dNTP和釋放的焦磷酸的物質(zhì)的量相等，反應(yīng)時(shí)dATP由deoxyadenosinealfa-thiotriphosphale(dATPaS)替代．因?yàn)镈NA聚合酶對(duì)dATPaS的催化效率比對(duì)dATP的催化效率高，且dATP是螢光素酶的底物，dATPctS不是。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，其物質(zhì)的量和焦磷酸一致。第23頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

ATP驅(qū)動(dòng)螢光素酶介導(dǎo)的螢光素向氧化螢光素(oxyluclferin)的轉(zhuǎn)化，氧化螢光素發(fā)出與ATP含量成正比的可見(jiàn)光信號(hào)。光信號(hào)由CCD攝像機(jī)檢測(cè)并通過(guò)相應(yīng)的軟件得到反映。每個(gè)峰的高度(光信號(hào)）與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)成正比，ATP和未摻入的dNTP由雙磷酸酶降解，猝滅光信號(hào)，并再生反應(yīng)體系，加入另一種dNTP進(jìn)行下一輪反應(yīng)。隨著以上過(guò)程的循環(huán)進(jìn)行，互補(bǔ)DNA鏈合成，DNA序列信號(hào)峰確定。該技術(shù)分析系統(tǒng)自動(dòng)化程度高，通量大，速度快，易于建立標(biāo)準(zhǔn)化操作，適合大規(guī)模SNP研究及基因分型。第24頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第25頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的檢測(cè)方法

動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交法(dynamicallelespecifichybridization,DASH)

用生物素標(biāo)記一條引物進(jìn)行目的DNA擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)生物素結(jié)合于鏈親和素包裹的微孔板壁，不帶生物素標(biāo)記的鏈用堿洗掉。加入探針和熒光染料，熒光染料SYBRGreenⅠ可特異性地插入ＤＮＡ雙鏈中，在激發(fā)光的作用下發(fā)出熒光，而在單鏈ＤＮＡ中則不能；探針和ＰＣＲ產(chǎn)物單鏈雜交后，在ＤＡＳＨ儀中微孔板持續(xù)緩慢升溫，同時(shí)連續(xù)檢測(cè)各孔中熒光強(qiáng)度，將溫度及各孔中對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度輸入計(jì)算機(jī),ＳＮＰ基因型與探針完全匹配的樣品在較高溫度才解鏈,因此在較高溫度才得到d(Fluorescence)/dt峰;與探針不完全匹配的樣品則在較低溫度時(shí)就得到d(Fluorescence)/dt峰，雜合子則得到兩個(gè)峰。第26頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR擴(kuò)增第27頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天鏈親和素包裹的微孔板

+

堿變性第28頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天持續(xù)緩慢升溫第29頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

第30頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的檢測(cè)方法

變性高效液相色譜(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,DHPLC)

原理第31頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第32頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第33頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第34頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第35頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的檢測(cè)方法

ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質(zhì)譜分析法(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-flightmassspectrometry)

原理：適當(dāng)大小的有機(jī)分子晶體(介質(zhì))用接近其吸收光譜的激光瞬時(shí)激發(fā)，會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移及解吸附過(guò)程。如將低濃度的蛋白質(zhì)或核酸分子加入介質(zhì)溶液中并加以干燥，蛋白質(zhì)或核酸分子將嵌入到介質(zhì)晶體中。將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空小室，用瞬時(shí)(納秒)強(qiáng)激光激發(fā)，晶體中的蛋白質(zhì)或核酸分子就會(huì)解吸附，轉(zhuǎn)變成氣相的離子態(tài)，此時(shí)可通過(guò)質(zhì)譜分析這些離子。第36頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的檢測(cè)方法

DNA芯片技術(shù)（DNAchip）

將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此之間重疊1個(gè)堿基，并覆蓋全部所需檢測(cè)的基因，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA分別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個(gè)堿基的差異，正常和突變的DNA將會(huì)得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過(guò)共聚集顯微鏡分別檢測(cè)兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)，即可確定是否存在突變，該方法快速簡(jiǎn)單、片動(dòng)化程度高，具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ瑢⒃诨蛲蛔儥z測(cè)中心發(fā)揮非常重要的作用。第37頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的應(yīng)用

SNP作圖

利用SNP圖譜搜尋遺傳致病基因

SNP在藥物設(shè)計(jì)中的作用

SNP在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

人類起源遷移進(jìn)化的研究第38頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1．人類基因單體型圖的繪制

大多數(shù)染色體區(qū)域具有少數(shù)幾個(gè)常見(jiàn)的單體型，代表了一個(gè)群體中人與人之間的大部分多態(tài)性。某些染色體區(qū)域可以有很多SNP位點(diǎn)，但是只用少數(shù)幾個(gè)標(biāo)簽SNPs，就能夠提供該區(qū)域內(nèi)大多數(shù)的遺傳多態(tài)性模式。繪制人類基因單體型圖的目的就是描述人類常見(jiàn)的遺傳多態(tài)性模式和染色體上具有成組緊密關(guān)聯(lián)SNPs的區(qū)域。第39頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天2002年10月，國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃(HapMap計(jì)劃)正式啟動(dòng)，截至目前已有超過(guò)150萬(wàn)SNPs被精確定位于各染色體上，并且已根據(jù)這些SNPs對(duì)來(lái)自4個(gè)不同人種的269份DNA樣品進(jìn)行了基因分型。后期目標(biāo)是要使總密度達(dá)到每500bP有一個(gè)SNP。通過(guò)不同個(gè)體基因組DNA的基因分型和頻率計(jì)算，繪制更加精密的單倍型圖譜。人類基因單體型圖的繪制完成，將為我們精確定位復(fù)雜疾病(如糖尿病，癌癥，心臟病，腦猝和哮喘等)易感基因提供重要信