細胞凋亡（科普詩）似秋葉凋零，告別生命之輝煌；那難以計數(shù)攻擊、誘導，輕啟著道道程序，逼細胞步步走向生命末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點一點擰淡;細胞凋亡和細胞壞死第1頁細胞凋亡（科普詩）似秋葉凋零，告別生命之輝煌；那難以計數(shù)攻擊、誘導，輕啟著道道程序，逼細胞步步走向生命末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點一點擰淡;細胞凋亡和細胞壞死第2頁危難中細胞啊，你沉穩(wěn)不亂，DNA片片切割，化云梯直通天堂；細胞體分團相聚，把生命凝重濃集在小體上；分別了朝夕相處搭檔，再見了高興美好時光；這一切一切又融入臨近胞體，騰出空間再寫生命篇章。

細胞凋亡和細胞壞死第3頁細胞死亡形式1.細胞壞死因為比較強烈有害刺激或細胞內(nèi)環(huán)境嚴重紊亂而造成細胞死亡。2.細胞凋亡由體內(nèi)外原因觸發(fā)細胞內(nèi)預(yù)存死亡程序而造成細胞死亡過程稱為細胞凋亡（apoptosis),又稱程序性細胞死亡（programmedcelldeath,PCD)。細胞凋亡和細胞壞死第4頁細胞凋亡和細胞壞死第5頁

壞死凋亡1.性質(zhì)病理性,非特異性生理性或病理性，特異性2.誘導原因強烈病理性刺激,隨機發(fā)生生理性或較弱病理性刺激,非隨機發(fā)生3.生化特點被動過程,無新蛋白合成,不耗能耗能主動過程，有新蛋白合成4.形態(tài)改變細胞結(jié)構(gòu)全方面溶解、破壞、細胞腫脹胞膜及細胞器相對完整細胞皺縮，核固縮,膜可發(fā)泡成芽,形成凋亡小體5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-120bp）,電泳呈“梯”狀條帶6.炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對完整，局部無炎癥反應(yīng)7.凋亡小體無有8.基因調(diào)控無有細胞凋亡與壞死比較細胞凋亡和細胞壞死第6頁細胞凋亡生理和病理意義1.確保正常發(fā)育、生長:指趾間隙形成；2.維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定:組織細胞更新(上皮組織/血細胞/衰老細胞)、生理器官內(nèi)分泌調(diào)控（子宮產(chǎn)后復員/月經(jīng)期子宮內(nèi)膜脫落）、受損不能修復細胞或突變細胞去除；3.發(fā)揮主動防御功效：病原微生物宿主細胞發(fā)生主動凋亡。細胞凋亡和細胞壞死第7頁細胞凋亡與疾病發(fā)生機制新認識1.該“死”細胞（如腫瘤細胞、本身反應(yīng)性免疫細胞）未死，是造成腫瘤、本身免疫性疾病主要發(fā)病機制之一?！毎蛲霾蛔?.不該“死”細胞（如神經(jīng)元、心肌細胞）死了，這與老年性癡呆、心肌缺血/再灌注損傷等發(fā)病相關(guān)。——細胞凋亡過分細胞凋亡和細胞壞死第8頁細胞凋亡過程1.凋亡信號轉(zhuǎn)導2.凋亡基因激活3.細胞凋亡執(zhí)行4.凋亡細胞去除細胞凋亡和細胞壞死第9頁凋亡過程及分期

誘導期執(zhí)行期消亡期

凋亡誘導因素受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺死亡信號凋亡相關(guān)基因激活Dnase激活Capases激活巨噬細胞吞噬細胞凋亡細胞細胞凋亡和細胞壞死第10頁凋亡時細胞主要改變一、細胞凋亡形態(tài)學改變1.細胞膜改變：微絨毛、細胞突起和細胞表面皺褶消失；胞膜空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不停擴張并與胞膜融合形成芽狀突起（出芽）；2.細胞質(zhì)改變：胞質(zhì)濃縮、細胞器改變（線粒體變大脊增多可空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴大提供包裹膜）；3.細胞核改變：核內(nèi)染色質(zhì)濃縮邊集空泡化、固縮、出芽、邊集、凋亡小體（apoposisboby）細胞凋亡和細胞壞死第11頁最早期形態(tài)學改變是細胞間間接丟失與鄰近細胞脫離并失去微絨毛胞漿濃縮及核質(zhì)密度增高（DNA斷裂）凋亡小體識別、吞噬（無炎癥反應(yīng)）細胞凋亡和細胞壞死第12頁

經(jīng)典凋亡小體（apoposisboby）：由透亮空泡和不透光濃密核碎片兩部分組成。細胞凋亡和細胞壞死第13頁胸腺細胞正常凋亡細胞凋亡和細胞壞死第14頁胸腺細胞正常凋亡細胞凋亡和細胞壞死第15頁細胞凋亡生化改變1.DNA片段化“梯”狀條帶2.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用3.凋亡蛋白酶（caspases）激活及其作用細胞凋亡和細胞壞死第16頁1.DNA片段化“梯”狀條帶為細胞凋亡主要特征①幾乎全部凋亡細胞都有核小體間裂解，造成DNA斷裂；②DNA降解過程特異性：不伴有組蛋白和其它核蛋白降解；③染色質(zhì)在核小體間裂解是凋亡細胞和形態(tài)改變基礎(chǔ)；④DNA片段化是凋亡“黃金標識”。細胞凋亡和細胞壞死第17頁細胞凋亡和細胞壞死第18頁2.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用由一系列胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導步驟激活，執(zhí)行染色質(zhì)DNA切割細胞凋亡和細胞壞死第19頁3.Caspase9激活，需要經(jīng)過CARD（caspase-recruitmentdomain)、Apaf-1、細胞色素c、ATP等多個因子參加1.滅活細胞凋亡抑制物（如Bcl-2）；2.水解細胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，造成細胞解體，形成凋亡小體（apoposisboby）；3.在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中水解相關(guān)活性蛋白，使該蛋白取得或喪失某種生物學功效Caspases在凋亡中主要作用細胞凋亡和細胞壞死第20頁細胞凋亡調(diào)控（一）細胞凋亡相關(guān)原因1.誘導性原因2.抑制性原因

(二)細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導細胞凋亡和細胞壞死第21頁1.細胞凋亡誘導原因.生理活性因子：TNF家族（Fas-L,TNF)、TGF、神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸、多巴胺)、生長因子撤退、GC等.損傷相關(guān)因子：熱休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射線等.化療藥品.毒素：乙醇、β-淀粉樣肽細胞凋亡和細胞壞死第22頁2.細胞凋亡抑制原因.凋亡相關(guān)基因抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。.生理性抑制劑：生長因子、細胞外基質(zhì)、鋅、雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒E1B、桿狀病毒p35、棒狀病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBVBHRF1等.藥品：Calpain抑制劑、caspases抑制劑、促癌劑、佛波豆蔻乙脂(PMA)等細胞凋亡和細胞壞死第23頁(二)細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導

-凋亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)特點①多樣性：不一樣種類細胞系統(tǒng)不一樣②偶聯(lián)性：與增殖分化信號系統(tǒng)交叉偶聯(lián)③同一性：多原因，共用同一系統(tǒng)觸發(fā)④多途性：同一誘導原因開啟多條信號轉(zhuǎn)導路徑細胞凋亡和細胞壞死第24頁㈡細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導誘導信號cellR神經(jīng)酰胺多路徑RSAPK/JNKP53基因NF-kB,JNK/AP-1路徑激活baxor下調(diào)bcl-2ROSmtDNA細胞凋亡和細胞壞死第25頁㈢細胞凋亡相關(guān)基因抑制凋亡基因：bcl-2促進凋亡基因：fas，P53雙向調(diào)控基因：c-myc，bclx細胞凋亡和細胞壞死第26頁Bcl-2抗凋亡機制①直接抗氧化②抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)③抑制促凋亡Bax，Bak細胞毒作用④抑制Caspases激活⑤維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)細胞凋亡和細胞壞死第27頁細胞凋亡發(fā)生機制（一）氧化損傷（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡(三)線粒體損傷細胞凋亡和細胞壞死第28頁（一）氧化損傷機制氧自由基可破壞機體正常氧化/還原動態(tài)平衡，造成生物大分子氧化損傷，干擾正常生命活動，形成嚴重氧化應(yīng)激狀態(tài)——后果：誘導細胞凋亡。細胞凋亡和細胞壞死第29頁（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡引發(fā)細

胞凋亡可能機制1.激活Ca2+/Mg2+依賴核酸內(nèi)切酶(DNase)，降解DNA鏈；2.激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細胞內(nèi)肽鏈間酰基轉(zhuǎn)移，在肽鏈間形成共價鍵，使細胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成；3.激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄；4.Ca2+在ATP配合下使DNA鏈舒展，暴露出核小體之間連接區(qū)內(nèi)酶切位點，有利于DNA內(nèi)切酶切割DNA。細胞凋亡和細胞壞死第30頁細胞凋亡生物學意義1.發(fā)育從低等動物到高等動物發(fā)育，都存在著程序性細胞死亡現(xiàn)象。2.免疫系統(tǒng)淋巴細胞發(fā)育分化成熟過程中，一直伴伴隨細胞凋亡。3.衰老細胞凋亡與許多年紀相關(guān)疾病有直接或間接聯(lián)絡(luò)。4.損傷與修復5.腫瘤發(fā)生細胞增殖與死亡速度平衡失調(diào)。6.病毒致病病毒表示抗凋亡蛋白。細胞凋亡和細胞壞死第31頁細胞凋亡和細胞壞死第32頁細胞凋亡檢測伴隨研究技術(shù)提升和對凋亡認識不停深入，檢測凋亡方法已從細胞、染色質(zhì)到分子水平日趨完善和成熟。1.形態(tài)學檢測2.DNA降解分析3.凋亡酶學分析4.凋亡相關(guān)蛋白分析5.流式細胞分析細胞凋亡和細胞壞死第33頁一．細胞凋亡形態(tài)學分析細胞凋亡形態(tài)學改變主要表現(xiàn)為：細胞皺縮(cellshrinkage)，失去細胞連接(celljunction)，微絨毛(microvilli)消失，發(fā)泡(blebbing)，染色質(zhì)濃集并靠近核膜，形成沿核膜收縮新月狀體(crescents)，形成凋亡小體(apoptoticbody)等。細胞凋亡和細胞壞死第34頁細胞凋亡形態(tài)學檢測方法檢測方法可判定凋亡細胞特征光學顯微鏡相差顯微鏡透射電鏡

聚焦激光掃描電鏡掃描電鏡流式細胞儀縮時攝影術(shù)細胞體積縮小、核濃縮、細胞周圍透明圈細胞發(fā)泡、凋亡小體微絨毛消失、染色質(zhì)沿核膜分布、新月體狀核、凋亡小體凋亡細胞內(nèi)固縮染色質(zhì)及核碎片定位細胞膜表面泡狀鼓起低前向散射光(FSC)、高側(cè)向散射光(SSC)凋亡細胞形成過程細胞凋亡和細胞壞死第35頁二.DNA降解分析DNA降解過程特點：1.發(fā)生于凋亡早期，由內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活引發(fā)2.DNA在核小體連接部位斷裂，產(chǎn)生180－200bp為最小單位單體或寡聚體片斷3.DNA碎片可被細胞膜包裹，形成凋亡小體細胞凋亡和細胞壞死第36頁

(一)DNA凝膠電泳原理：凋亡細胞降解產(chǎn)生一系列規(guī)則DNA片斷，其電泳結(jié)果呈經(jīng)典“梯狀帶”(ladder)；而壞死或凋亡后壞死細胞DNA分解是隨機，產(chǎn)生碎片分子量大小不一，在電泳時形成“涂片狀”(smear)。普通瓊脂糖凝膠電泳、Southernblotting、放射自顯影(32PdATP或32PdCTP連接到DNA片斷3’端)細胞凋亡和細胞壞死第37頁(二)原位標識法TUNEL(TdTmediateddUTPnick

endlabeling)終末脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導原位缺口末端標識技術(shù)。原理：在TdT作用下，帶有標識物dUTP被連接在斷裂DNA3’末端，然后經(jīng)過對應(yīng)方法檢測標識物，從而判斷是否有凋亡發(fā)生。應(yīng)用范圍：石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)細胞、組織中分離細胞 細胞凋亡和細胞壞死第38頁(三)ELISA法

原理：以抗組蛋白抗體包被微孔板壁，加入標本，凋亡細胞核小體可與抗體結(jié)合，再加入抗-DNA片斷-POD復合物，與核小體中DNA片斷結(jié)合，最終加入POD顯色底物，以酶標儀測定光密度以進行定量分析。細胞凋亡和細胞壞死第39頁三.凋亡酶學分析1.內(nèi)切核酸酶(endonuclease,DNase)

種類：DNaseⅠ（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體),DNaseⅡ（溶酶體、胞核)，NUC18（胞核，胸腺細胞中)等

作用：使DNA斷裂成180－200bp或其倍數(shù)片斷

激活機制：CAD(caspase-activateDNase)ICAD(inhibtorofCAD)

檢測：WesternBlotting細胞凋亡和細胞壞死第40頁Caspases檢測

1.Caspase-3活性測定(FI