擬南芥（Arabidopsisthaliana）是一個(gè)模式植物，含有基因組?。?25Mbp）、生長(zhǎng)周期短等特點(diǎn)，而且基因組測(cè)序已經(jīng)完成（TheArabidopsisGenomicInitiative,）。從遺傳學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，基因克隆路徑可概括為正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)兩種。正向遺傳學(xué)路徑指是經(jīng)過(guò)被克隆基因產(chǎn)物或表現(xiàn)型突變?nèi)ミM(jìn)行反向遺傳學(xué)路徑則指是依據(jù)被克隆基因在染色體上位置來(lái)實(shí)現(xiàn)擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第1頁(yè)圖位克隆（map-basedcloning）又稱定位克?。╬ositionalcloning），1986年首先由劍橋大學(xué)AlanCoulson提出，用該方法分離基因是依據(jù)目標(biāo)基因在染色體上位置進(jìn)行，無(wú)需預(yù)先知道基因DNA序列，也無(wú)需預(yù)先知道其表示產(chǎn)物相關(guān)信息。它是經(jīng)過(guò)分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)識(shí)連鎖關(guān)系來(lái)確定突變表型遺傳基礎(chǔ)。圖位克隆能實(shí)現(xiàn)，關(guān)鍵在于全基因組(Col-0生態(tài)型)測(cè)序計(jì)劃完成和各種分子標(biāo)識(shí)發(fā)覺(jué)。這些數(shù)據(jù)被儲(chǔ)存在專門數(shù)據(jù)庫(kù)中（表1）。擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第2頁(yè)擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第3頁(yè)分子標(biāo)識(shí):實(shí)現(xiàn)基因圖位克隆關(guān)鍵是篩選與目標(biāo)基因連鎖分子標(biāo)識(shí)。分子標(biāo)識(shí)是一個(gè)特異DNA片段或能夠檢出等位基因，對(duì)其有效地利用即可到達(dá)圖位克隆基因之目標(biāo)。迄今為止，已經(jīng)有幾十種技術(shù)可用于分子標(biāo)識(shí)篩選,其中最為慣用是簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（SSLP）,和單核苷酸多態(tài)性（SNP）。擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第4頁(yè)SSLP：簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)是基于PCR分子標(biāo)識(shí)，在擬南芥基因組中有較多分布（在Col和Ler兩個(gè)生態(tài)型中，每1000bp有4—11個(gè)不一樣序列），而且是共顯性，它檢測(cè)非常直接，需要設(shè)計(jì)引物來(lái)檢測(cè)假定SSLP標(biāo)識(shí)擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第5頁(yè)SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性，它是擬南芥不一樣生態(tài)型之間基因組中單個(gè)核苷酸差異，這些差異核苷酸通常位于不編碼區(qū)域。最常見(jiàn)用于檢測(cè)SNP標(biāo)識(shí)方法主要是剪切（酶解）擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS），它也是基于PCR。擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第6頁(yè)因?yàn)橛辛藬M南芥基因組序列和高密度遺傳標(biāo)識(shí)，圖位克隆過(guò)程就變得相對(duì)直接。從基于Col-0和Ler遺傳背景突變體出發(fā)，我們有可能在大約一年時(shí)間內(nèi)找出與這個(gè)突變相關(guān)基因，作為作圖過(guò)程第一步，突變體植株將和另外一個(gè)生態(tài)型（Col-0或者Ler）植株雜交。然后播種F1代種子。在F1代植物生長(zhǎng)過(guò)程中，我們就有可能來(lái)對(duì)其表現(xiàn)型和基因型進(jìn)行分析。F1代植物表型出現(xiàn)或者消失將顯示著我們所研究突變是顯性還是隱性。擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第7頁(yè)col0誘變繁種淘汰致死突變和不能繁殖突變篩選突變體處理Landsberg野生型×確定突變體是否是單基因突變及顯隱性突變體篩選擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第8頁(yè)基因圖位克隆aaAA×Col-0突變體Landsberg野生型F1aA×1234512345aAaAAAaaF2粗定位在大多數(shù)情況下，用于雜交突變體植株是作為父本還是母本是沒(méi)相關(guān)系。擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第9頁(yè)aaaaaaaamakerCol-0Ler單交換雙交換不交換不交換重組率＝單交換＋2×雙交換2×樣品總數(shù)×100％Col-0LerCol-0Ler擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第10頁(yè)在15個(gè)maker中，重組率最小者距目標(biāo)基因最近細(xì)定位a粗定位maker細(xì)定位maker細(xì)定位maker在3個(gè)maker中，重組率最小者目標(biāo)基因距該maker最近循環(huán)若干次擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)第11頁(yè)普通情況下能在突變兩側(cè)找到相距小于40Kb兩個(gè)分子標(biāo)識(shí)。找到之后，就能夠經(jīng)過(guò)測(cè)序來(lái)找到突變基因。一個(gè)有效方法是設(shè)計(jì)PCR引物來(lái)擴(kuò)增覆蓋這40Kb多個(gè)重合500bp片段。將這些片段測(cè)序后拼接起來(lái)以得到整個(gè)40Kb序列，然后將它與野生型植物（Col-0或者Ler）序列進(jìn)行比對(duì)，這就能夠找到這個(gè)區(qū)域中多個(gè)基因。從一系列侯選基因中判定基因是定位克隆技術(shù)最終一個(gè)關(guān)鍵步驟?，F(xiàn)在最慣用方法是用含有目標(biāo)基因大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去篩選cDNA文庫(kù)，并查詢生物數(shù)據(jù)信息庫(kù)，待找出侯選基因后，把這些侯選基因進(jìn)行以下分析以確定目標(biāo)基因：（1）準(zhǔn)確定位法檢驗(yàn)cDNA是否與目標(biāo)基因共分離；（2）檢驗(yàn)cDNA時(shí)空表示特點(diǎn)是否與表型一致；（3）測(cè)定cDNA序列，查詢數(shù)據(jù)庫(kù)，以了解該基因功效；（4）篩選