基因診療與基因治療

GeneDiagnosisandGeneTherapy第二十八章基因診療與基因治療第1頁第一節(jié)基因診療學基礎第二節(jié)遺傳病基因診療第三節(jié)腫瘤基因診療第四節(jié)基因診療在法醫(yī)學上應用

第五節(jié)基因治療概念及策略

本章內(nèi)容提要基因診療與基因治療第2頁第一節(jié)

基因診療學基礎

BasisofGeneDiagnostics基因診療與基因治療第3頁基因診療之父—簡悅威1976年加州大學華裔科學家KanYW用核酸分子雜交技術(shù)首次對一例α地中海貧血進行診療?；蛟\療與基因治療第4頁一、基因診療概念、特點及臨床意義

定義：利用分子生物學技術(shù)，經(jīng)過檢測基因及基因表示產(chǎn)物存在狀態(tài)，對人體疾病作出診療方法。

基因診療檢測目標分子是DNA、RNA，也能夠是蛋白質(zhì)或者多肽。

基因診療與基因治療第5頁診療依據(jù)(遺傳物質(zhì)改變)DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平改變，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有、癌基因表示水平從低到高；基因結(jié)構(gòu)改變，如點突變引發(fā)基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引發(fā)基因異常激活或滅活?；蛟\療與基因治療第6頁基因診療特點高特異性高靈敏性早期診療性應用廣泛性基因診療與基因治療第7頁二、基因診療中慣用分子生物學技術(shù)核酸分子雜交（Nucleicacidhybridization）聚合酶鏈式反應(PCR)單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）DNA序列測定（DNAsequencing）生物芯片（biochips）Western免疫印跡（Westernblotting）免疫組織化學診療基因診療與基因治療第8頁（三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）

DNA突變造成DNA片段堿基序列不一樣，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中構(gòu)象不一樣（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率差異可使各種序列不一樣單鏈分離開來。基因診療與基因治療第9頁PCR-SSCP分析原理示意基因診療與基因治療第10頁正常人純合突變雜合突變+PCR-SSCP分析

－基因診療與基因治療第11頁基因診療中慣用分子生物學方法比較方法特點核酸分子雜交結(jié)果可靠但操作繁瑣PCR靈敏度、特異性高SSCP操作簡便、檢出率不高RFLP結(jié)果可靠但限制較多DNA測序可自動化生物芯片效率高，成本高基因診療與基因治療第12頁三、基因診療技術(shù)路線與方法

直接診療：直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表示是否異常間接診療：利用多態(tài)性遺傳標志與致病基因進行連鎖分析依據(jù)對致病基因或相關(guān)基因了解程度決定基因診療技術(shù)路徑選擇?；蛟\療與基因治療第13頁（一）直接診療路徑

必要條件：◆被檢測基因改變與疾病發(fā)生有直接因果關(guān)系◆被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定◆被檢基因致病分子機制（突變位點或表示改變）已知基因診療與基因治療第14頁5/——5/—3/3/—RFLP1.點突變檢測

（1）有限制性內(nèi)切酶位點改變基因診療與基因治療第15頁斑點雜交、反向斑點雜交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR產(chǎn)物直接測序5/——5/—3/3/—（2）無限制性酶切位點改變

基因診療與基因治療第16頁

在DNA序列上有一段較長序列重新排布。包含數(shù)十個堿基到數(shù)千個堿基丟失、插入、替換、重復和倒位等，以及染色體突變或畸變，包含染色體易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等。

2.基因重排檢測核酸分子探針雜交與PCR基因診療與基因治療第17頁3.基因表示異常檢測

mRNA相對定量分析mRNA絕對定量分析

mRNA長度分析基因診療與基因治療第18頁（二）間接診療路徑1.采取原因致病基因未知或基因結(jié)構(gòu)不確定致病突變機制不清致病位點不便檢測基因診療與基因治療第19頁

DNA多態(tài)性：指群體中DNA分子存在最少兩種不一樣類型，即個體間同一染色體相同位置上核苷酸序列存在一定差異或變異。多在進化中形成，本身并不致病，只是與一些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系。2.遺傳標識基因診療與基因治療第20頁間接診療：檢測與致病基因連鎖遺傳標識三代遺傳標識：

RFLP（基于核酸分子雜交技術(shù)）

VNTR(variablenumberoftandemrepeats);

STR(shorttandemrepeats)

SNP(singlenucleotidepolymorphism)基因診療與基因治療第21頁第五節(jié)

基因治療概念及策略

ConceptandStrategyofGeneTherapy基因診療與基因治療第22頁定義：

經(jīng)過在特定靶細胞中表示該細胞原來不表示基因，或采取特定方式關(guān)閉、抑制異常表示基因，到達治療疾病目標治療方法?；蛟\療與基因治療第23頁本節(jié)內(nèi)容提要

一、基因治療策略

二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

三、基因干預

四、基因治療應用研究

五、基因治療前景與問題基因診療與基因治療第24頁一、基因治療策略基因診療與基因治療第25頁

（一）基因置換（genereplacement）

定義：指將特定目標基因?qū)胩囟毎?jīng)過定位重組，導入正?；颍灾脫Q基因組內(nèi)原有缺點基因。目標：將缺點基因異常序列進行橋正。對缺點基因缺點部位進行準確原位修復，不包括基因組任何改變?；蛟\療與基因治療第26頁（二）基因添加（geneaugmentation）

定義:

經(jīng)過導入外源基因使靶細胞表示其本身不表示基因。類型:在有缺點基因細胞中導入對應正?；颍毎麅?nèi)缺點基因并未除去，經(jīng)過導入正?；虮硎井a(chǎn)物，賠償缺點基因功效；向靶細胞中導入靶細胞原來不表示基因，利用其表示產(chǎn)物到達治療疾病目標?；蛟\療與基因治療第27頁（三）基因干預（geneinterference）

定義：采取特定方式抑制某個基因表示，或者經(jīng)過破壞某個基因結(jié)構(gòu)而使之不能表示，以到達治療疾病目標?；蛟\療與基因治療第28頁定義：將“自殺”基因?qū)胨拗骷毎?，這種基因編碼酶能使無毒性藥品前體轉(zhuǎn)化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產(chǎn)生“自殺”效應，從而到達去除腫瘤細胞目標。應用：是惡性腫瘤基因治療主要方法之一。（四）自殺基因治療(SuicideGeneTherapy)基因診療與基因治療第29頁自殺基因作用機制

基因診療與基因治療第30頁（五）基因免疫治療經(jīng)過將抗癌免疫增強細胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中抗癌免疫反應?；蛟\療與基因治療第31頁二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

基因診療與基因治療第32頁基因治療兩種路徑載體目標基因invivoexvivo靶細胞基因診療與基因治療第33頁

基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)技術(shù)

1.病毒介導基因轉(zhuǎn)移2.非病毒介導基因轉(zhuǎn)移基因診療與基因治療第34頁

1.病毒介導基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移效率較高，所以它也是使用最多基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計，有72%臨床試驗計劃和71%病例使用了病毒載體，其中用得最多是反轉(zhuǎn)錄病毒載體?；蛟\療與基因治療第35頁反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)及生活周期（1）反轉(zhuǎn)錄病毒

基因診療與基因治療第36頁反轉(zhuǎn)錄病毒介導基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

——由兩部分組成反轉(zhuǎn)錄病毒載體：其基因組為缺點型，保留了病毒包裝信號ψ，而缺失病毒包裝蛋白基因.輔助細胞株：能合成包裝蛋白，用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝，但本身卻不能包裝成輔助病毒顆粒。

基因診療與基因治療第37頁Retroviralpackagingsystem基因診療與基因治療第38頁

（2）腺病毒(adenovirus)載體

腺病毒是一個大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它經(jīng)過受體介導內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。

基因診療與基因治療第39頁腺病毒優(yōu)點基因?qū)胄矢?，對人類安全；宿主范圍廣；基因轉(zhuǎn)導與細胞分裂無關(guān)；重組腺病毒可經(jīng)過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因?；蛟\療與基因治療第40頁

2.非病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉?；驹?利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，能夠自動形成包埋外源DNA脂質(zhì)體，然后與細胞一起孵育，即可經(jīng)過細胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目標基因）轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，并進行表示。

基因診療與基因治療第41頁脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)移示意圖基因診療與基因治療第42頁

（2）受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù)

將DNA與細胞或組織親和性配體偶聯(lián)，可使DNA含有靶向性。

多聚陽離子與配體共價連接后，又經(jīng)過電荷相互作用與帶負電荷DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這么形成復合物可被帶有特異性受體靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞。基因診療與基因治療第43頁受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖基因診療與基因治療第44頁

（3）基因直接注射技術(shù)

不需要進行基因工程繁瑣操作，直接將裸露DNA注入動物肌肉或一些器官組織內(nèi)。動物試驗表明：接收注射外源DNA小鼠能夠按其基因編碼合成對應蛋白質(zhì)，并能維持數(shù)月之久。

將促進心臟血管生長基因直接注入試驗鼠心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細血管增加30%～40%；將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺乏胰島素；肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需凝血因子Ⅸ?；蛟\療與基因治療第45頁三、基因干預

（geneinterference）

基因診療與基因治療第46頁（一）反義RNA（antisenseRNA）

1.反義RNA與基因表示調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)細胞進行基因表示調(diào)控，通常采取方法有兩種：

（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義RNA重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用?；蛟\療與基因治療第47頁2.受體介導反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù)①受體介導RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；②被轉(zhuǎn)移RNA是被保護，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸保護層,能夠抵抗環(huán)境中核酸酶降解作用。借助前述受體介導基因轉(zhuǎn)移方法，能夠?qū)崿F(xiàn)受體介導反義RNA轉(zhuǎn)移?；蛟\療與基因治療第48頁（二）核酶(ribozyme)

在基因治療時，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當部位，形成錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，經(jīng)過破壞靶RNA分子而到達治療疾病目標。

基因診療與基因治療第49頁

1.核酶設計（1）選擇適當靶部位，該部位含有核酶切割位點，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。（2）核酶基本組成：用于基因治療核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導序列?；蛟\療與基因治療第50頁核酶作用機制

基因診療與基因治療第51頁

2.核酶應用與普通反義RNA相比，核酶含有較穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶攻擊。更主要是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它mRNA分子。

基因診療與基因治療第52頁（三）RNA干擾

1.RNA干擾現(xiàn)象RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一個由雙鏈RNA誘發(fā)基因緘默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因表示?；蛟\療與基因治療第53頁RNA干擾機制示意圖基因診療與基因治療第54頁四、基因治療應用研究

基因診療與基因治療第55頁（一）遺傳病基因治療研究

(一)遺傳病基因治療必須符合以下要求1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因表示不需要準確調(diào)控；4.該基因能在一個便于臨床操作組織細胞中表示并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴重后果(如不治療難以存活等)?？晒┻x擇并符合上述4條以上要求不過只有30余種遺傳病?；蛟\療與基因治療第56頁腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)