本標準由國家認證認可監(jiān)督委員會提出并歸口。本標準起草單位；中華人民共和國山東出入境檢驗檢疫局。本標準主要起草人；高宏偉、梁成珠，劉心同、王巖、于立欣、曹患雷。本標準系首次發(fā)布的出入境檢驗檢疫行業(yè)標準。青椒中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測方法本標準規(guī)定了轉(zhuǎn)基因青椒中外源基因CaMV35S、NPTⅡ、NOS,CMV定性PCR檢測方法。本標準適用于對青椒樣品的轉(zhuǎn)基因篩選檢測，適用于抗黃瓜花葉病毒轉(zhuǎn)基因青椒的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。SN/T1193基因檢驗實驗室技術(shù)要求SN/T1204植物及其加工品中轉(zhuǎn)基因成分實時熒光PCR檢測方法3術(shù)語，定義和縮略語下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本標準。3.1術(shù)語和定義轉(zhuǎn)基因transgene將本物種不具有的，來源于其他物種的功能DNA序列，通過各種導(dǎo)入手段，使其在該物種中進行表達，以便使該物種獲得新的品種特征。聚合酶鏈反應(yīng)polymerasechainreaction,PCR模板基因序列先經(jīng)過高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計的兩條引物分別于模板DNA兩條鏈上的一段互補序列發(fā)生退火而相互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的催化下以四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)為底物，使引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性，退火和廷伸這一循環(huán)，使欲擴增的基因片段呈幾何倍數(shù)擴增。rheL.ribulosebisphosphatecarboxylase/osygenaseLargesu核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基基因，由植物葉綠體基因組編碼?；ㄒ嘶ㄈ~病毒35S啟動子。NPTImeomycinphosphotra新霉素-3*-磷酸轉(zhuǎn)移酶。NOSnopalinesynthaseterminator胭脂堿合成醇3’轉(zhuǎn)錄終止子。2CMVcucumbermosaievir黃瓜花葉病毒。樣品經(jīng)過提取DNA后，針對轉(zhuǎn)基因植物所插人的外源基因的基因序列設(shè)計引物，通過PCR技術(shù)，特異性擴增外源基因的DNA片段，根據(jù)PCR擴增結(jié)果，判斷該樣品中是否含有該轉(zhuǎn)基因成分。檢測先對提取的DNA進行內(nèi)對照的擴增，擴出相應(yīng)的內(nèi)對照條帶后可以進行篩選基因的檢測，如果篩選基因為陽性，再進行鑒定基因的檢測。如果篩選基因為陰性則直接報告結(jié)果。檢測過程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的規(guī)定執(zhí)行。按照表1中提供的引物序列合成引物，加入無離子水配成100pmol/pL.貯存，配成直接用于PCR反應(yīng)的10pmol/pL.的工作液。表1轉(zhuǎn)基因青椒PCR檢測用的引物序列及PCR產(chǎn)物的大小TagDNA聚合酶，瓊脂糖(電泳純)溴化乙錠，三氯甲烷，異丙醇，70%乙醇，分子量標準(100bp~TE緩沖液：10mmol/LTrisHCl(pH8.0),10×PCR緩沖液：100mmol/1.氯化鉀，160mmol/L(Mg5O?),200mL.加蒸餾水至1000mL;使用時10倍稀釋。溴化乙錠貯存液；用雙燕水配制成10mg/mL.。CTAB提取緩沖液：1%CTAB,0.05mol/LTris-HCl(pH8.0)0.01mol/L.EDTA(pH8.0)。固體粉碎機或研體，高速冷凍離心機，臺式小型離心機，Mini個人離心機，天平(感量0.001g)旋渦4XdNTP(2.5mmol/L,含dUTP)物1(10pmol/pL}TugDNA聚合酶(5U/pL)UNG酶(1U/eL)氧化鎂(MgCl?)(25mmol/L)使反應(yīng)體積達到25μl.稱取2.0g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液(0.5×TBE)中，用微波爐加熱溶解瓊脂糖，冷卻至55℃~60℃左右加入溴化乙錠(EB)至終濃度為0.5pg/mL,制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液(0,5×TBE),使液而剛剛沒過凝膠。將8μL～10pL.PCR擴增產(chǎn)物和2pL.加樣緩沖液混合，點樣。每行膠孔中選一個膠孔，在其中加入DNA分子量標記以判斷PCR擴增產(chǎn)物大小。電壓大小一般控制在3V/cm~5V/em,電泳時間約35mim,或者根據(jù)溴酚藍的移動位置來確定，電泳結(jié)果用凝膠成像儀記錄并保存。8結(jié)果判定8.1判斷提取的DNA質(zhì)量使用內(nèi)參照引物rbel.擴增樣品的DNA,如果陰性對照、樣品和陽性對照的PCR產(chǎn)物都出現(xiàn)433bp的條帶，則表明提取的樣品DNA符合PCR反應(yīng)的要求，可以用于外源基因檢測；否則不能用于檢測外源基因，應(yīng)該重新提取樣品DNA。8.2篩選基因的判定使用篩選基因的引物CaMV35S,NOS,NPTⅡ?qū)悠稤NA進行PCR擴增，如果陰性對照和空白對照未出現(xiàn)擴增條帶，陽性對照和待測樣品均出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，則可以初步判斷該樣品含有外源基因，應(yīng)該進一步進行確證實驗，依照確證實驗的結(jié)果最終報告。如果陰性對照和樣品都未出現(xiàn)擴增的PCR產(chǎn)物，而陽性樣品出現(xiàn)擴增的PCR產(chǎn)物，則可以判斷待測樣品中不含有該外源基因。8.3鑒定基因判定對于青椒中轉(zhuǎn)基因成分的檢測，先檢測CaMV35S,NOS,NPTⅡ基因。如果檢測結(jié)果陰性則報告結(jié)果。如果檢測結(jié)果陽性，則進行鑒定檢測CMV基因，以確定轉(zhuǎn)基因青椒