一種人類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種人類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法技術(shù)領(lǐng)域：：本發(fā)明涉及一種人類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域：。背景技術(shù)：：基因工程(geneengineering)，又稱(chēng)為重組DNA技術(shù)，是按著人們的科研或生產(chǎn)需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(zhì)(DNA片段)，在體外切割，拼接形成重組DNA，然后將重組DNA與載體的遺傳物質(zhì)重新組合，再將其引入到?jīng)]有該DNA的受體細(xì)胞中，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，生產(chǎn)出符合人類(lèi)需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。按目的基因的克隆和表達(dá)系統(tǒng)，分為原核生物基因工程，酵母基因工程，植物基因工程和動(dòng)物基因工程?；蚬こ叹哂袕V泛的應(yīng)用價(jià)值，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)開(kāi)辟了新的應(yīng)用途徑，也為遺傳病的診斷和治療提供了有效方法?；蚬こ踢€可應(yīng)用于基因的結(jié)構(gòu)，功能與作用機(jī)制的研究，有助于生命起源和生物進(jìn)化等重大問(wèn)題的探討。轉(zhuǎn)基因的高效表達(dá)問(wèn)題是基因工程及基因治療領(lǐng)域人們最關(guān)心的問(wèn)題之一，但由于位置效應(yīng)等導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默、表達(dá)水平較低卻是轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中普遍存在的一種現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，有時(shí)通過(guò)Southernblot、RT_PCR等證實(shí)轉(zhuǎn)基因已整合到宿主的基因組中，且保留完整的拷貝，但是卻不能穩(wěn)定表達(dá)或表達(dá)水平低下，有時(shí)甚至完全被抑制。這種外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)受到抑制的現(xiàn)象稱(chēng)之為轉(zhuǎn)基因沉默(transgenesilencing)，其主要原因是轉(zhuǎn)基因之間或轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源的同源基因之間存在著序列同源性的緣故。利用核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(matrixattachmentregion，MAR)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的克服外源基因失活的一種有效方法。MAR序列，即核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(matrixattachmentregion,MAR)序列，亦稱(chēng)核骨架結(jié)合區(qū)(scaffoldattachmentregion,SAR)序列，是真核生物染色質(zhì)上可與細(xì)胞核基質(zhì)結(jié)合的一段特殊DNA序列。目前已有不少利用核基質(zhì)結(jié)合區(qū)提高外源基因表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。很多實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，MAR序列能克服外源基因沉默，提高報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平(見(jiàn)王健美，張可偉，葉文靜，等.MAR序列研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，33(2)244-247.)。不同插入位點(diǎn)的MAR對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影口向不同(見(jiàn)ZhangJH,JingCQ,YangXJ,etal.PositionaleffectsofthematrixattachmentregionontransgeneexpressioninstablytransfectedCHOcells[J].CellBiolInt·2010,34(2):141-145.)。即使是同一MAR在不同的表達(dá)宿主中對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響亦存在差異(見(jiàn)余惠明，王天云.β-珠蛋白MAR對(duì)轉(zhuǎn)基因在不同細(xì)胞中表達(dá)的影響[J]·第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(14):1261-口63.)，另外研究還發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的MAR對(duì)外源基因表達(dá)的影響不一(見(jiàn)AllenGC，SpikerS，ThompsonWF.Useofmatrixattachmentregions(MARs)tominimizetransgenesilencing[J].PlantMolBiol,2000,43(2-3):361-376.KimJM,KimJS,ParkDH,etal.ImprovedrecombinantgeneexpressioninCHOcellsusingmatrixattachmentregions[J].JBiotechnol，2004，3107(2):95-105.BrouwerC，BruceW,MaddockS，etal.Developmentofstablecelllinesforproductionorregulatedexpressionusingmatrixattachmentregionsinmaize:adualforthemaize5'ADHlmatrixattachmentregion[J].PlantCell，2002,14(9)2251-2264.)0盡管前期有一些關(guān)于利用MAR構(gòu)建的人類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的報(bào)道，但都存在轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平不高，載體所介導(dǎo)的為報(bào)告基因，載體不含多克隆位點(diǎn)等缺點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可高效表達(dá)目的基因的人類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的表達(dá)載體，是在pCAT3-C0ntr0l載體骨架上含有β-珠蛋白MAR序列及β-干擾素MAR序列；所述的pCAT3-Control載體骨架上，在SV40啟動(dòng)子上游插入β-干擾素MAR序列，在SV40latepoly(A)region下游插入β-珠蛋白MAR序列；pCAT3-contro1上的CAT基因替換為多克隆位點(diǎn)，該多克隆位點(diǎn)是由限制性內(nèi)切酶NcoI、SacI、MluI、NheI、XmaIJhoI.XbaI酶切位點(diǎn)所組成，所述的多克隆位點(diǎn)的5'、3'端分別為NcoI.XbaI酶切位點(diǎn)，中間為&icI、MluI、NheI、XmaI.XhoI五個(gè)酶切位點(diǎn)的任意排列。所述β-珠蛋白MAR序列的GenBank編號(hào)為L(zhǎng)22754.1，β-干擾素MAR的GenBank編號(hào)為M83137.1。為方便進(jìn)行真核抗性篩選，在pCAT3-C0ntr0l載體骨架上SV40Enhancer下游插入真核抗性基因選擇復(fù)合體，該復(fù)合體自上游至下游依次包括SV40早期啟動(dòng)子、抗性基因以及HSV-TKpolyA；所述的SV40早期啟動(dòng)子是GenBank中編號(hào)為X99274的核苷酸序列的第6850-7187位核苷酸，HV-TKpolyA是GenBank中編號(hào)為ABMM35的核苷酸序列的第3867-3885位核苷酸。所述的抗性基因的選擇是廣泛的，如Neomycin(Neo,Kan/G418耐受)、Zeomycin,Hygromycin或GFP/Neo抗性基因等，優(yōu)選Neomycin抗性基因，GenBank中編號(hào)為AFl13968的核苷酸序列的第2277-3080位核苷酸。所述表達(dá)載體可按照基因工程領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種人類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的用途。本發(fā)明人類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體能夠顯著提高外源基因的表達(dá)，可用于制備基因治療制劑。本發(fā)明提供一種人類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，該載體是利用pCAT3-C0ntr0l作為出發(fā)載體構(gòu)建的一種表達(dá)載體。在本發(fā)明的表達(dá)載體中的多克隆位點(diǎn)插入目的基因，構(gòu)建表達(dá)載體。本發(fā)明的表達(dá)載體能夠顯著提高所攜帶的目的基因的表達(dá)水平，比目前不含MAR及以其他方式插入MAR的表達(dá)載體可提高25倍以上。因此，針對(duì)目前基因工程領(lǐng)域的基因沉默現(xiàn)象，本發(fā)明的表達(dá)載體具有顯著提高外源基因表達(dá)的效果。圖1是pCAT3_control載體的物理圖譜；4圖2是表達(dá)載體pMAR的物理圖譜；圖3是表達(dá)載體pMAR-VEGF的物理圖譜；圖4是實(shí)施例2中各實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組的VEGF蛋白表達(dá)水平的灰度比值柱形圖；1未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的骨髓干細(xì)胞VEGF表達(dá)量；2轉(zhuǎn)化不含MAR序列表達(dá)載體VEGF表達(dá)量；3轉(zhuǎn)化表達(dá)盒兩側(cè)含有β-珠蛋白MAR表達(dá)載體VEGF表達(dá)量；4轉(zhuǎn)化本發(fā)明所述表達(dá)載體VEGF表達(dá)量。具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明所述載體的應(yīng)用。特別需要指出的是，本發(fā)明說(shuō)明書(shū)所舉實(shí)施例只是為了幫助理解本發(fā)明，他們不具任何限制作用，即本發(fā)明除說(shuō)明書(shū)所舉實(shí)例外，還可以有其他實(shí)施方式。因此，凡是采用等同替換或等效變換形式形成的任何技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍中。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、pCAT-3-control質(zhì)粒載體，所使用的細(xì)胞系、質(zhì)粒載體和試劑、工具酶均為市售商品。pCAT-3-control質(zhì)粒載體購(gòu)自于Promega生物公司。實(shí)施例1表達(dá)載體pMAR載體的構(gòu)建(1)含β-珠蛋白MAR序列的表達(dá)載體的PCAMl構(gòu)建①PCR擴(kuò)增目的片段根據(jù)β-珠蛋白MAR序列(GenBank登錄號(hào)為L(zhǎng)227M.1)，設(shè)計(jì)引物Pl和Ρ2，引物的5‘端分別引入MlI/BamHI酶切位點(diǎn)，引物序列如下(下劃線為酶切位點(diǎn))Pl5'-GTCGTCGACAAGCTTCTGACAAATTATTCTTCC-3'；Ρ25'-AGCGGATCCGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG-3'；提取人外周血基因組DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板，使用引物Pl和Ρ2擴(kuò)增β-珠蛋白MAR序列，PCR反應(yīng)體系如下(反應(yīng)總體系為25μL):PCR艮應(yīng)體系試劑濃度f(wàn)tfUpl)終濃度IOxPCRbuffer231X模板DKtAIOOiigZpL1.04血PCR條件如下95°C3min，94°C40s，6056°C30s,72°C40s，每個(gè)退火溫度4個(gè)循環(huán)，最后55°C，30個(gè)循環(huán)，72°C3min。瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送生物公司測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，擴(kuò)增出的DNA片段與Genbank登錄的β-珠蛋白MAR序列完全一致。②構(gòu)建含β-珠蛋白MAR序列的pCAMl載體用MlI/BamHI雙酶切β-珠蛋白MAR序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的序列)，同時(shí)用SalI/BamHI雙酶切pCAT3_control質(zhì)粒DNA，酶切體系為質(zhì)粒5μL，IOXMbuffer2μL,SalI/BamHI酶各0.5μL，補(bǔ)足水至20μL，酶切條件為37°C，3min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收β-珠蛋白MAR序列片段和pCAT3-C0ntr0l線形質(zhì)粒；酶切回收后的β-珠蛋白MAR片段及pCAT3-Control線性質(zhì)粒DNA，按1:5(摩爾比)進(jìn)行連接，16°C連接過(guò)夜；然后將連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將100200μL轉(zhuǎn)化后的Ε.coliJM109菌液接種在含有氨芐青霉素LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落繼代培養(yǎng)，并進(jìn)行重組質(zhì)粒的雙酶切(SalI/BamHI)驗(yàn)證，選取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將目的基因序列完全正確的載體命名為PCAM1。(2)含β-干擾素MAR序列的表達(dá)載體的PCAM2構(gòu)建。①PCR擴(kuò)增目的片段根據(jù)β-干擾素MAR序列(GenBank登錄號(hào)為Μ83137.1)，設(shè)計(jì)引物Ρ3和Ρ4，為實(shí)現(xiàn)定向克隆，引物的5'端分別引入Bgl11/KpnI酶切位點(diǎn)，引物序列如下(下劃線為酶切位占)·P35'-GTCAGACTCGAATTCAGCAAGGTCGCCACGCACA-3'；P45'-GTCGGTACCCTATCAAGATATTTAAAGAAAAAAAAAT-3'；提取人外周血基因組DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板，使用引物P3和P4擴(kuò)增β-干擾素MAR序列，PCR反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)體系試劑濃度體積(μ)終濃度Taq醜5U,'pL0.5OJU/pLPCR條件如下95°C3min，94°C40s，6056°C30s,72°C40s，每個(gè)退火溫度4個(gè)循環(huán)，最后55°C，30個(gè)循環(huán)，72°C3min。瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送生物公司測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，擴(kuò)增出的DNA片段與GenBank登錄的β-干擾素MAR序列完全一致。②構(gòu)建含β-珠蛋白MAR序列的pCAMl載體用BglII/KpnI雙酶切β-干擾素MAR序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的序列)，同時(shí)用BglII/KpnI雙酶切pCAMl質(zhì)粒DNA，酶切體系為質(zhì)粒5μL，IOXMbuffer2yL,BglII/KpnI酶各0.5μL，補(bǔ)足水至20μL，酶切條件為37°C，3min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收β-干擾素MAR序列片段和pCAMl線形質(zhì)粒；酶切回收后的β-干擾素MAR片段及PCAMl線形質(zhì)粒DNA，按1:5(摩爾比)進(jìn)行連接，16°C連接過(guò)夜；然后將連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將100200μL轉(zhuǎn)化后的Ε.coliJM109菌液接種在含有氨芐青霉素LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落繼代培養(yǎng)，BglII/KpnI雙酶切重組質(zhì)粒載體，選取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將目的基因序列完全正確的載體命名為PCAM2。(3)含neomycin真核抗性基因選擇復(fù)合體的表達(dá)載體的pCAMN構(gòu)建。①PCR擴(kuò)增neomycin真核抗性基因選擇復(fù)合體根據(jù)neomycin真核抗性基因選擇復(fù)合體序列(GenBank登錄號(hào)為EF437957.1)。設(shè)計(jì)引物P5和P6，引物的5'端分別引入MlI酶切位點(diǎn)，引物序列如下(下劃線為酶切位點(diǎn))P55'-GTCGTCGACCTGTGGAATGTGTGCAGTTAGGGTGTGGA-3'；P65'-AGCGTCGACCAGACATGATAAGATACATTGATGAGA-3'；提取質(zhì)粒ρ⑶NA3.1，作為PCR擴(kuò)增的模板，使用引物P5和P6擴(kuò)增neomycin真核抗性基因選擇復(fù)合體序列，PCR反應(yīng)體系同表2，PCR條件如下95°C3min,94°C40s,6030s,72°C408，30個(gè)循環(huán)，7213min。瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送生物公司測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，擴(kuò)增出的DNA片段與GenBank登錄的neomycin真核抗性基因選擇復(fù)合體序列完全一致。②構(gòu)建含neomycin真核抗性基因選擇復(fù)合體的表達(dá)載體pCAMN用MlI單酶切PCR產(chǎn)物，酶切體系為質(zhì)粒5yL，10Xbuffer2μL,SalI酶0.5μL，補(bǔ)足水至20μL，酶切條件為37°C，3min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收neomycin抗性基因片段(G418篩選)；同時(shí)用MlI單酶切載體pCAM2，用堿性磷酸酶處理PCAM2線性質(zhì)粒；酶切回收后的neomycin抗性基因片段及經(jīng)堿性磷酸酶處理過(guò)的pCAM2按15(摩爾比)用T4連接酶進(jìn)行連接，16°C連接過(guò)夜；然后將連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將100200μL轉(zhuǎn)化后的Ε.coliJM109菌液接種在含有氨芐青霉素LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落繼代培養(yǎng)，并進(jìn)行重組質(zhì)粒的雙酶切(SalI/BamHI)驗(yàn)證，選取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將目的基因序列完全正確的載體命名為pCAMN。(4)含多克隆位點(diǎn)的表達(dá)載體pMAR構(gòu)建①人工合成多克隆位點(diǎn)根據(jù)NcoI、SacI,MluI,NheI,XmaI,XhoI,XbaI的酶切位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)下列一段序列5‘-GCCAGCCCATGGGAGATCACGGCTGCTAGCCCCGGGCTCGAGTCTAGATAG-3‘，由生物公司合成。②構(gòu)建含多克隆位點(diǎn)的表達(dá)載體pMAR用NcoIAbaI酶切人工合成的多克隆位點(diǎn)DNA片段，酶切pCAMN，酶切體系為質(zhì)粒5μL，IOXbuffer2μL,Ncol/XbaI酶各0.5μL，補(bǔ)足水至20μL，酶切條件為37°C，:3min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收；將回收的多克隆位點(diǎn)DNA片段和pCAMN線性質(zhì)粒按1:5(摩爾比)用T4連接酶進(jìn)行連接，16°C連接過(guò)夜；然后將連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將100200μL轉(zhuǎn)化后的Ε.coliJM109菌液接種在含有氨芐青霉素LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落繼代培養(yǎng)，并進(jìn)行重組質(zhì)粒的雙酶切(NcoIAbaI)驗(yàn)證，選取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將序列完全正確的載體命名為pMAR(質(zhì)粒圖譜如圖2所示)。實(shí)施例2利用本發(fā)明的表達(dá)載體在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)VEGF基因。(1)含有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF基因)載體pMAR-VEGF的構(gòu)建根據(jù)人的VEGF基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào)為AF022375.1)設(shè)計(jì)PCR引物P7和P8，為實(shí)現(xiàn)定向克隆，引物的5'端分別引入NcoIAbaI酶切位點(diǎn)，引物序列如下(下劃線為酶切位點(diǎn))P75'-GGCCCATGGATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG-3'；P85'-GCGAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTG-3'。取胎兒心肌組織，Trizol法提取總RNA，用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。在25μL的反應(yīng)體系中，分別加入dNTPlμL(10mmol/L),RNA1μg，濃度為20ymol/L的P7和P8引物各1μL，AMV-TaqDNA聚合酶1μL(5U/μL)以及AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μL(5U/μL)，按照OneStepPCRKit(AMV)操作說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)50°C30min，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；然后按如下參數(shù)94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送生物公司測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，擴(kuò)增出的DNA片段與GenBank登錄的VEGF基因cDNA序列完全一致；用Ncol/XbaI雙酶切VEGF基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的序列)，同時(shí)用NcoIAbaI雙酶切pAMR質(zhì)粒DNA，酶切方法參考實(shí)施例1中酶切體系及條件，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收VEGF基因序列片段和pAMR線形質(zhì)粒；酶切回收后的VEGF基因cDNA序列片段及pAMR線性質(zhì)粒DNA按1:5(摩爾比)進(jìn)行連接，16°C連接過(guò)夜；然后將連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將100200μL轉(zhuǎn)化后的Ε.coliJM109菌液接種在含有氨芐青霉素LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落繼代培養(yǎng)，Ncol/XbaI雙酶切重組質(zhì)粒載體，選取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將目的基因序列完全正確的載體命名為pMAR-VEGF(質(zhì)粒圖譜如圖3所示)。(2)pMAR-VEGF轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞