實(shí)驗(yàn)十

生物材料石蠟包埋實(shí)驗(yàn)

（洗滌、脫水、透明、透蠟與包埋）石蠟切片的主要步驟：一、取材二、固定三、洗滌四、脫水五、透明六、透蠟與包埋七、切片八、貼片九、染色十、封藏一、實(shí)驗(yàn)原理：1、洗滌洗滌是洗去滲入細(xì)胞內(nèi)部的固定液。因?yàn)椴牧现械墓潭ㄒ河械臅?huì)妨礙染色；有的會(huì)發(fā)生沉淀或結(jié)晶；有的會(huì)繼續(xù)與組織作用，使材料變壞等。因此要徹底洗凈固定液。2、脫水:

材料經(jīng)洗滌后含有大量的水分，必須用脫水劑脫盡里面的水分，有利于材料的透明和制片的保存。因?yàn)樗謺?huì)使材料分解，而且透明劑與水是不相混合的，因此只有在完全無(wú)水的情況下，透明劑才能完全透入到組織當(dāng)中。3、透明：是指利用透明劑既可與脫水劑相混合又能和石蠟相混合的性質(zhì)，將脫水劑替換出來(lái)，使石蠟?zāi)茼樌M(jìn)入材料中，達(dá)到不同程度的透明狀態(tài)。4、透蠟：是指將材料中的透明劑逐步清除，以至完全由石蠟充分滲透。5、包埋：是把被石蠟浸透的材料連同熔化的石蠟一起倒入一定形狀的容器內(nèi)，并立即讓其冷卻，使它凝固成含材料的蠟塊，以備切片。常用的脫水劑：

酒精、丙酮、甘油、正丁醇、二氧乙環(huán)等。常用的透明劑：

二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油等。透明劑都是石蠟的溶劑，絕大多數(shù)不能與水混合。常用的包埋劑：石蠟（熔點(diǎn)42～60℃），分軟蠟（熔點(diǎn)42～50℃）和硬蠟（熔點(diǎn)52～60℃），一般動(dòng)物材料最常用52～56℃熔點(diǎn)的硬蠟。夏季采用高熔點(diǎn)的石蠟，冬季則采用低熔點(diǎn)的石蠟。二、實(shí)驗(yàn)步驟1、洗滌

材料自固定液中取出，放入指形管或廣口瓶，加入半管水，用紗布將管口扎住，置于水槽內(nèi)，進(jìn)行流水沖洗。注意水流不宜太急，以免沖壞材料。流水沖洗時(shí)間一般需要12～24小時(shí)。沖洗時(shí)應(yīng)注意以下事項(xiàng)：

水溶性的固定劑：需用流水沖洗。酒精溶劑的固定劑：應(yīng)用同濃度的酒精浸洗。含苦味酸的固定劑：（苦味酸與甲醛混合液除外），須用70％酒精浸洗，以免水洗后固定作用消失。福爾馬林固定劑：除長(zhǎng)期存放外，一般可以不沖洗。

含有升汞固定劑：組織經(jīng)固定后應(yīng)在沖洗劑－水或酒精中加碘以洗去組織內(nèi)汞的沉淀。含有鉻酸的固定劑：組織在沖洗時(shí)最好置于暗處，以免產(chǎn)生沉淀或使組織硬化而影響制片。

2、脫水材料自低濃度至高濃度的酒精進(jìn)行脫水。一般經(jīng)50%、70%、80%、95%直至純酒精。每級(jí)停留約30分鐘至1小時(shí)。如需過(guò)夜，應(yīng)停留在70%酒精中。脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象。脫水時(shí)的注意事項(xiàng)：①脫水必須要在有瓶蓋的器皿中進(jìn)行，尤其是高濃度乙醇很容易吸收空氣中的水份。②組織由低濃度向高濃度的乙醇轉(zhuǎn)移時(shí)，要用吸水紙吸干余液，以免將水份帶入。③在低濃度酒精中，每級(jí)停留時(shí)間不宜太長(zhǎng)，否則易使組織變軟，助長(zhǎng)材料的解體。④在高濃度或純酒精中，每級(jí)停留時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)使組織變脆，影響切片。3、透明透明也是漸次由低濃度至高濃度進(jìn)行，要求每級(jí)更換動(dòng)作要迅速，蓋好相應(yīng)的蓋子。材料先在純酒精和二甲苯各半的混合液浸15～30分鐘，再轉(zhuǎn)入純二甲苯中透明（至透明為止），一般15～30分鐘。若透明過(guò)程中，材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說(shuō)明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。總的透明時(shí)間不宜超過(guò)3h。4、透蠟

材料自二甲苯中取出后，先移入二甲苯和石蠟等量的混合液中約30分鐘（透蠟格1），然后進(jìn)入純石蠟中約40～60分鐘（透蠟格2），

再換純石蠟一次約40～60分鐘（透蠟格3）。透蠟溫度要恒定（放置60℃水浴鍋中)，一般要求在52～56℃之間，以石蠟不凝固為好，并且要在最短的時(shí)間內(nèi)完成，以免組織變硬、變脆、收縮等。透蠟格:5、包埋從自動(dòng)熔蠟機(jī)中取出石蠟?zāi)Ｗ?下圖)注入適當(dāng)?shù)氖?，再用溫鑷子取出透蠟?中的組織樣品，迅速轉(zhuǎn)移到已注入石蠟的石蠟?zāi)Ｗ拥撞?中央)，放上包埋盒(預(yù)先在包埋盒側(cè)面做好標(biāo)記，文字面朝上)，再注入石蠟(不溢出包埋盒為宜)，轉(zhuǎn)移石蠟?zāi)Ｗ拥奖嫔?，待石蠟完全凝固（約30分鐘）后取出包埋盒，備用。所有用過(guò)的石蠟?zāi)Ｗ佣家呕厝巯灆C(jī)中，以便再次使用。

注意：包埋盒請(qǐng)標(biāo)明學(xué)生姓名、組織樣品名稱，以免混淆或拿錯(cuò)。普通包埋機(jī)帶冷臺(tái)包埋機(jī)包埋過(guò)程標(biāo)記注入適當(dāng)石蠟放入組織樣品正確放入包埋盒再注入石蠟并移至冰面凝固取出具體操作步驟：取材(鼠肝、脾、腎、心3mm)

→固定(10％福爾馬林，12～24h)

↙

(流水沖洗12～24h)

洗滌↙

脫水→50%乙醇，30min→70%乙醇,30min

→80%乙醇，30min

→95%乙醇,30min

→無(wú)水乙醇，30min

透明→50%純乙醇﹢50%二甲苯，15min

→純二甲苯，30min（出現(xiàn)霧狀，重新脫水)

透蠟→二甲苯﹢等量石蠟，56℃水浴鍋，30min

→純石蠟，56℃水浴鍋，40min

→純石蠟，56℃水浴鍋，60min

包埋→用包埋機(jī)包埋，每盒放1個(gè)組織塊，放冰上冷卻，待石蠟?zāi)毯笕〕鰝溆?。三、?shí)驗(yàn)用品1、器材：水浴鍋、透蠟格、包埋機(jī)、石蠟?zāi)Ｗ印窈?、鑷子、方盤等。2、試劑：各級(jí)酒精（50、70、80、9