ICS65.020.20

B21DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3860—2020

玉米品種及純度鑒定技術(shù)規(guī)程SNP標(biāo)記法

Technicalregulationforidentificationofmaizevarietiesandpurity—

SNPmarkermethod

2020-10-13發(fā)布2020-11-13實(shí)施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3860—2020

玉米品種及純度鑒定技術(shù)規(guī)程SNP標(biāo)記法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用?SNP（singlenucleotidepolymorphism）標(biāo)記進(jìn)行玉米品種及純度鑒定的原理、儀

器設(shè)備及試劑、引物信息、操作步驟等要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米自交系、單交種及純度的鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣

GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

SNP?標(biāo)記singlenucleotidepolymorphismmarker

基于單核苷酸多態(tài)性的分子標(biāo)記。

3.2

推薦引物recommendedprimer

品種鑒定中優(yōu)先選用的一套?SNP?引物，其檢測位點(diǎn)多態(tài)性高，檢測結(jié)果重復(fù)性好。

3.3

競爭性等位基因特異性?PCR（KASP,KompetitiveAlleleSpecificPCR）

通過引物末端特異性堿基競爭性匹配?DNA?模板實(shí)現(xiàn)?SNP?基因分型的鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)。

3.4

品種純度varietalpurity

品種在?DNA?分子標(biāo)記基因分型方面一致的程度，用供檢樣品中本品種的種子數(shù)占供檢樣品種子總

數(shù)的百分率表示。

1

DB32/T3860—2020

4原理

玉米基因組中普遍存在著單堿基的變異，不同品種同一?SNP?位點(diǎn)的基因型可利用適宜引物通過

?KASP?檢出，進(jìn)而根據(jù)?SNP?位點(diǎn)基因型的差異鑒定品種及純度。

5儀器設(shè)備及試劑

見附錄A。

6引物信息

見附錄B。

7操作步驟

7.1樣品?DNA?提取

7.1.1樣品準(zhǔn)備

試驗(yàn)樣品種子的分樣與保存，應(yīng)符合GB/T3543.2的規(guī)定。

7.1.2用于品種鑒定樣品?DNA?提取

從送檢樣品中隨機(jī)抽取?10?粒種子發(fā)苗。分單株剪取?100?mg?幼苗用液氮研磨，將研磨粉末轉(zhuǎn)入

?2?mL?離心管，加入?0.5?mL?2×CTAB?提取緩沖液充分混勻。在55℃?～65℃?恒浴?30?min。加入?1?mL?氯

仿:異戊醇（24：1），充分搖動(dòng)?5?min，8?000?g，室溫下離心?5?min。取上清液加入0.6×體積異丙醇，室

溫下靜置?30?min，5?000?g，4?℃?離心?5?min。沉淀用?0.8?mL?高鹽緩沖液充分溶解，15?000?g?離心?2min。

上清加入?0.6×體積異丙醇，室溫下靜置?30?min，5?000?g，4?℃?離心?5?min。沉淀用?400μL?雙蒸水溶解，

加入?2.5×體積?95%?的預(yù)冷乙醇，﹣20?℃?冰箱放置?2h?以上，15?000g離心?20min。用?70%?的預(yù)冷乙

醇洗一次，自然干燥后，用?200?μL?0.1×TE?緩沖液溶解，置?4?℃?保存。

注：以上為推薦用于品種鑒定的?DNA?提取方法，其他能夠達(dá)到?PCR?擴(kuò)增質(zhì)量要求的?DNA?提取方法都適用于本標(biāo)

準(zhǔn)。

7.1.3用于純度鑒定樣品?DNA?提取

按GB/T3543.4規(guī)定的方法，從送檢樣品中抽取不少于?100?粒種子發(fā)苗。分單株剪取0.5cm～1cm

長的幼苗，放入?96?孔?PCR?板的孔中，每孔?1?株幼苗樣品。每孔加入?40μL?DNA?提取試劑盒Ⅰ緩沖液，

在沸水中煮沸?30?s，然后加入?60?μLDNA?提取試劑盒Ⅱ緩沖液，在沸水中煮沸?2?min，置?4?℃?保存，保

存不超過?7?d。

注：以上為推薦用于純度鑒定的?DNA?提取方法，其他能夠達(dá)到?PCR?擴(kuò)增質(zhì)量要求的?DNA?提取方法都適用于本標(biāo)

準(zhǔn)。

7.2PCR?擴(kuò)增

7.2.1引物篩選

用于品種及純度鑒定的?40?組推薦引物及其序列參見附錄B。

2

DB32/T3860—2020

自行篩選引物時(shí)，取送檢雜交種及父、母本種子各?5?粒，通過?KASP?對一系列?SNP?分子標(biāo)記引物

進(jìn)行篩選，確定適宜的引物。適宜引物應(yīng)為能夠清晰區(qū)分雜交種及其父、母本的共顯性引物。

7.2.2PCR?反應(yīng)體系

在?5?μL?的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含?0.07μL?引物?KASP?Assaymix，2.5?μL2×KASP

Mastermix，50?ng?模板?DNA。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：PCR?程序?yàn)?94?℃?預(yù)變性?15?min；94?℃?變性?20?s，61?℃?

退火和延伸?60?s，10個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)降低?0.6?℃；94?℃?變性?20?s，55?℃?退火和延伸?60?s，26?個(gè)循

環(huán)。反應(yīng)利用?96?孔?PCR?板在?PCR?擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

7.3基因分型檢測

在微孔板熒光分析儀上讀取熒光信號(hào),使用熒光結(jié)果處理軟件按照分型明確、NTC(無樣品陰性對

照)無特異性擴(kuò)增的原則進(jìn)行樣品?SNP?分型。

7.4數(shù)據(jù)采集與判定

7.4.1數(shù)據(jù)記錄

純合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為?X/X?和?Y/Y，其中?X、Y?為同一位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異；雜合

位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為?X/Y；缺失位點(diǎn)等位變異數(shù)據(jù)記錄為?-/-。

7.4.2品種鑒定的判定

根據(jù)送檢樣品在?40?個(gè)?SNP?位點(diǎn)基因型的差異進(jìn)行品種鑒定，具體判定標(biāo)準(zhǔn)如下：

——差異位點(diǎn)數(shù)≥?4，判定為不同品種；

——差異位點(diǎn)數(shù)≥?1且≤?3，判定為近似品種；

——差異位點(diǎn)數(shù)=?0，判定為極近似或相同品種。

對利用附錄B中40組引物仍未檢測到≥?4個(gè)差異位點(diǎn)數(shù)的樣品，必要時(shí)可增加自行篩選引物進(jìn)行

檢測。

7.4.3純度鑒定的判定

品種純度按照下列公式計(jì)算：

品種純度%（自交系）=（供檢種子粒數(shù)-非本品種種子粒數(shù)）/供檢種子粒數(shù)×100%

品種純度%（單交種）=（供檢種子粒數(shù)-母本種子粒數(shù)-其他類型種子粒數(shù)）/供檢種子粒數(shù)×100%

3

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

儀器設(shè)備及試劑配制

A.1儀器設(shè)備

儀器設(shè)備包括：

——微孔板熒光分析儀；

——PCR?擴(kuò)增儀；

——電子天平（感量0.01?g，0.001?g）；

——冰箱；

——微量加樣器（0.1?μL?～?2.5?μL,0.5?μL?～?10?μL,20?μL?～?200?μL,100?μL?～?1?000?μL）；

——磁力攪拌器；

——高壓滅菌鍋；

——酸度計(jì)等；

——離心管（0.5?mL，1.5?mL）；

——吸頭(10?μL，200?μL，1?000?μL)；

——96孔?PCR?板；封板膜；

——一次性手套；

——離心管架；

——水平儀。

A.2試劑配制

A.2.1DNA?提取試劑Ⅰ

稱取?1?g?氫氧化鈉溶于?99?mL?水中。

A.2.2DNA?提取試劑Ⅱ

取?10?mL?12?mol/L?的鹽酸溶于?470?mL?水中即成?0.25?mol/L?鹽酸。將?0.25?mol/L?鹽酸與

?0.5?mol/L?Tris(PH8.0)按?2：1?稀釋。

A.2.31?mol/L?Tris?溶液(PH8.0)

稱取?121.1?g?三羥甲基氨基甲烷（Tris），加入?800?mL?雙蒸水中溶解，加入濃鹽酸?58.4?mL，加水

定容至?1?000?mL。

A.2.40.5?mol/L?EDTA?溶液（PH8.0）

稱取?186.6?g?乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA?2H2O），加入?700?mL?雙蒸水中溶解，加入?20?g?氫氧

化鈉，加水定容至?1?000?mL。

A.2.52×CTAB?提取緩沖液

4

DB32/T3860—2020

2%CTAB（w/v），100?mmol/L?Tris(pH8.0)，20?mmol/L?EDTA?(pH8.0)，1.4?mol/L?氯化鈉，1%??PVP

Mr40000。稱取?20?g?十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，81.9?g?氯化鈉，10?g?聚乙烯吡咯烷酮（PVP），

加入100?mL?1?mol/L?Tris溶液?(PH8.0)和?40?mL?0.5?mol/L?EDTA?溶液（PH8.0），加水定容至?1?000?mL。

A.2.6高鹽緩沖液

10?mmol/L?Tris?(pH8.0)，1?mmol/LEDTA(pH8.0)，1mol/L?氯化鈉。稱取?58.5g?氯化鈉,加入?10mL

1?mol/L?Tris?溶液?(PH8.0)和?2?mL?0.5?mol/L?EDTA?溶液（PH8.0），加水定容至?1?000?mL。

A.2.70.1xTE?緩沖液

1?mmol/L?Tris(pH8.0)，0.1?mmol/L?EDTA?(pH8.0)，1?mL?1mol/L?Tris?溶液(PH8.0)和?0.2?mL?0.5

mol/L?EDTA?溶液（PH8.0），加水定容至?1?000?mL。

A.2.82×KASPMastermix?試劑

包含?TaqDNA?聚合酶、帶有熒光的接頭序列、鎂離子、四種脫氧核糖核苷酸（dNTP），ROX?內(nèi)參

熒光染料。

A.2.9KASPAssaymix

包含?46?μL?ddH2O、12?μL?100?μmol/L?特異性引物F1、12?μL?100?μmol/L?特異性引物F2、

30?μL?100?μmol/L?通用引物。

5

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BB

附錄B

（規(guī)范性附錄）

推薦使用的40?組?SNP?引物序列及其玉米基因組分布

推薦使用的?40?組?SNP?引物序列及其玉米基因組分布見表B.1。

表B.140?組?SNP?引物序列及其玉米基因組分布

染引物序列（5'-3'）PCR擴(kuò)增序列（bp）b

引物名稱色擴(kuò)增

正向a反向（通用）起始位置終止位置

體長度

catgtaaataggaaccttgttctcgtA

JAASKASP11agtcactcaaacatgttcgttgtccaaa443781524437820756

atgtaaataggaaccttgttctcgtC

tgcattggctgacatggtaC

JAASKASP21acttgcagaagctccagagt11233739311233747280

tgcattggctgacatggtaG

agcataactaggacaaccattgaT

JAASKASP31ggaactaatggcacggttcc15820113315820118755

agcataactaggacaaccattgaG

aacatgtgatggtttgggtatgG

JAASKASP41cattcgtcaatgatgtgcagct29275123129275128050

aacatgtgatggtttgggtatgC

cctcctcccaacaatgtcagcA

JAASKASP52gattgtttrtgccatataacttgcaggttt2501058250110952

ctcctcccaacaatgtcagcG

agcattctacatgtcgcgcA

JAASKASP62ggagaacctcgtcgatagcg875197218751977151

agcattctacatgtcgcgcC

ttgaaatgttacgaatgtaaggacT

JAASKASP72ggctgctctaaattacggca12634182512634187854

ttgaaatgttacgaatgtaaggacC

ccactagcagaagcaatgcaaA

JAASKASP82gcacacagtttggtgacatgt23617325523617331258

ccactagcagaagcaatgcaaG

acatgaagaagagccacgaA

JAASKASP93tgcttccagttccaagctcc106922091069227466

acatgaagaagagccacgaG

cctccactttgtcatcgttccA

JAASKASP103tgtgtgccattaatgatgcact657910396579109658

cctccactttgtcatcgttccT

tcgagtagtgtaagtggtagcaA

JAASKASP113acgaattcttgtgctcccca16918005116918013383

tcgagtagtgtaagtggtagcaC

gctagagatccaagatttgtttgtT

JAASKASP123gtgaagacggtcgtttgtgc21090261521090268571

gctagagatccaagatttgtttgtC

tcacctccttttccggcaaC

JAASKASP134gctctgacttggaatgccca6610435661048551

tcacctccttttccggcaaG

gctcttgtgtattcgggcaC

JAASKASP144aacacatgaagcgagacgga337281133372816250

gctcttgtgtattcgggcaG

cagatctgattgcttgttattggtA

JAASKASP154aggagtagctcgatcagatgt17054451317054456452

cagatctgattgcttgttattggtG

6

DB32/T3860—2020

表B.140?組?SNP?引物序列及其玉米基因組分布（續(xù)）

ttcccagatctacaacaggatgcA

JAASKASP164cagtgacrtcaccaagcaatctaaagat23901467423901473461

cccagatctacaacaggatgcG

actttattgtccccagctagttttA

JAASKASP175aaattagactgcggctgccc324820053248208278

actttattgtccccagctagttttG

agttagccactctaatctgtccaG

JAASKASP185aagttaatctakattagctggccttcttgt718752117187526454

tagttagccactctaatctgtccaA

gcgagcttggattagatagtttgA

JAASKASP195ctctgcatgacaacctccga14751903014751908758

gcgagcttggattagatagtttgG

cgtatcacaaactcgcacgatT

JAASKASP205tggatgaaagtggcgtttgc17403606117403611959

cgtatcacaaactcgcacgatC

cattgcaaggctcctgaacA

JAASKASP216ggaaccagagcgcaaacatag6019073601917098

cattgcaaggctcctgaacG

acatactctcgacagattagttggA

JAASKASP226tcgacgatcagttccgtagc763994517639950151

acatactctcgacagattagttggG

acctctttacaccccttcacaT

JAASKASP236aggcaagccatggagtttct817739598177403678

acctctttacaccccttcacaG

ctgctatagtgctagttacatggtA

JAASKASP246cgagcagccgtgattttcaa14227410814227416962

ctgctatagtgctagttacatggtG

agcactgtgcaacagctaccaC

JAASKASP257tccaaaaccactgcaaacataaaggctaa202581842025826279

cagcactgtgcaacagctaccaT

gcggaggtagaaatttgggttT

JAASKASP267cggcggtggttttgattcag848808278488089569

gcggaggtagaaatttgggttA

gcatcaccaaagtcaccagtgcA

JAASKASP277gctgaagttggcgtcatgatggtta10353577810353582952

catcaccaaagtcaccagtgcG

tagcagagctgatcggagcC

JAASKASP287tacaagtggtcgtgcgtctt16138816416138822158

tagcagagctgatcggagcA

acgaccagatccatgaaaaggatA

JAASKASP298tcgacgacaagatgtgggtg328644353286449056

acgaccagatccatgaaaaggatC

agtggttgtttctagccaacA

JAASKASP308aaagcagccaaacagaccct894758558947591763

agtggttgtttctagccaacC

tgttattggtggggtgggaA

JAASKASP318ttccaccgtccaacagacat10197099010197103950

tgttattggtggggtgggaC

ccggttcgatgccacacatA

JAASKASP328ggtttgatgcaccaccacac17484108917484117587

ccggttcgatgccacacatC

aagcacacctcaggctggaC

JAASKASP339gccagctatcatccacaggg166822271668229165

aagcacacctcaggctggaT

catctgttaagttaaggcccttatA

JAASKASP349gccaagatgggaggtttgga663294236632947654

catctgttaagttaaggcccttatC

atacgcacagcaggtcagcA

JAASKASP359ccaggaggagacaggatgga10436011710436019377

atacgcacagcaggtcagcG

7

DB32/T3860—2020

表B.140?組?SNP?引物序列及其玉米基因組分布（續(xù)）

cggaggagacctgaatcatctaG

JAASKASP369agccaaacgacatgaagggt14563170214563177372

cggaggagacctgaatcatctaA

gcatctgggactgctctgaT

JAASKASP3710gccccagctgtcctactgta165778511657790858

gcatctgggactgctctgaC

ggggattcgaaccaaaccaG

JAASKASP3810ccgatctgtttcgcagccta630628986306295154

ggggattcgaaccaaaccaA

agtgtgctcctttggaaaacT

JAASKASP3910cgtcgtgcttgtcttctcca10633155910633161355

agtgtgctcctttggaaaacC

agacgccaaatgactaaatccaA

JAASKASP4010gagcaaccagtttccccagt14427418714427424256

agacgccaaatgactaaatccaG

a每組正向引物上面序列為F1，由FAM熒光標(biāo)記；下面序列為F2，由HEX熒光標(biāo)記；變異堿基由序列尾部

大寫字母表示。

b起始及終止位置基于B73參考基因組（V3）。

_______________________

8

DB32/T3860—2020

前??言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙涵、張?bào)w付、呂遠(yuǎn)大、陳艷萍、林峰、陸海燕、梁帥強(qiáng)。

I

DB32/T3860—2020

玉米品種及純度鑒定技術(shù)規(guī)程SNP標(biāo)記法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用?SNP（singlenucleotidepolymorphism）標(biāo)記進(jìn)行玉米品種及純度鑒定的原理、儀

器設(shè)備及試劑、引物信息、操作步驟等要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米自交系、單交種及純度的鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣

GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

SNP?標(biāo)記singlenucleotidepolymorphismmarker

基于單核苷酸多態(tài)性的分子標(biāo)記。

3.2

推薦引物recommendedprimer

品種鑒定中優(yōu)先選用的一套?SNP?引物，其檢測位點(diǎn)多態(tài)性高，檢測結(jié)果重復(fù)性好。

3.3

競爭性等位基因特異性?PCR（KASP,KompetitiveAlleleSpecificPCR）

通過引物末端特異性堿基競爭性匹配?DNA?模板實(shí)現(xiàn)?SNP?基因分型的鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)。

3.4

品種純度varietalpurity

品種在?DNA?分子標(biāo)記基因分型方面一致的程度，用供檢樣品中本品種的種子數(shù)占供檢樣品種子總

數(shù)的百分率表示。

1

DB32/T3860—2020

4原理

玉米基因組中普遍存在著單堿基的變異，不同品種同一?SNP?位點(diǎn)的基因型可利用適宜引物通過

?KASP?檢出，進(jìn)而根據(jù)?SNP?位點(diǎn)基因型的差異鑒定品種及純度。

5儀器設(shè)備及試劑

見附錄A。

6引物信息

見附錄B。

7操作步驟

7.1樣品?DNA?提取

7.1.1樣品準(zhǔn)備

試驗(yàn)樣品種子的分樣與保存，應(yīng)符合GB/T3543.2的規(guī)定。

7.1.2用于品種鑒定樣品?DNA?提取

從送檢樣品中隨機(jī)抽取?10?粒種子發(fā)苗。分單株剪取?100?mg?幼苗用液氮研磨，將研磨粉末轉(zhuǎn)入

?2?mL?離心管，加入?0.5?mL?2×CTAB?提取緩沖液充分混勻。在55℃?～65℃?恒浴?30?min。加入?1?mL?氯

仿:異戊醇（24：1），充分搖動(dòng)?5?min，8?000?g，室溫下離心?5?min。取上清液加入0.6×體積異丙醇，室

溫下靜置?30?min，5?000?g，4?℃?離心?5?min。沉淀用?0.8?mL?高鹽緩沖液充分溶解，15?000?g?離心?2min。

上清加入?0.6×體積異丙醇，室溫下靜置?30?min，5?000?g，4?℃?離心?5?min。沉淀用?400μL?雙蒸水溶解，

加入?2.5×體積?95%?的預(yù)冷乙醇，﹣20?℃?冰箱放置?2h?以上，15?000g離心?20min。用?70%?的預(yù)冷乙

醇洗一次，自然干燥后，用?200?μL?0.1×TE?緩沖液溶解，置?4?℃?保存。

注：以上為推薦用于品種鑒定的?DNA?提取方法，其他能夠達(dá)到?PCR?擴(kuò)增質(zhì)量要求的?DNA?提取方法都適用于本標(biāo)

準(zhǔn)。

7.1.3用于純度鑒定樣品?DNA?提取

按GB/T3543.4規(guī)定的方法，從送檢樣品中抽取不少于?100?粒種子發(fā)苗。分單株剪取0.5cm～1cm

長的幼苗，放入?96?孔?PCR?板的孔中，每孔?1?株幼苗樣品。每孔加入?40μL?DNA?提取試劑盒Ⅰ緩沖液，

在沸水中煮沸?30?s，然后加入?60?μLDNA?提取試劑盒Ⅱ緩沖液，在沸水中煮沸?2?min，置?4?℃?保存，保

存不超過?7?d。

注：以上為推薦用于純度鑒定的?DNA?提取方法，其他能夠達(dá)到?PCR?擴(kuò)增質(zhì)量要求的?DNA?提取方法都適用于本標(biāo)

準(zhǔn)。

7.2PCR?擴(kuò)增

7.2.1引物篩選

用于品種及純度鑒定的?40?組推薦引物及其序列參見附錄B。

2

DB32/T3860—2020

自行篩選引物時(shí)，取送檢雜交種及父、母本種子各?5?粒，通過?KASP?對一系列?SNP?分子標(biāo)記引物

進(jìn)行篩選，確定適宜的引物。適宜引物應(yīng)為能夠清晰區(qū)分雜交種及其父、母本的共顯性引物。

7.2.2PCR?反應(yīng)體系

在?5?μL?的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含?0.07μL?引物?KASP?Assaymix，2.5?μL2×KASP

Mastermix，50?ng?模板?DNA。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：PCR?程序?yàn)?94?℃?預(yù)變性?15?min；94?℃?變性?20?s，61?℃?

退火和延伸?60?s，10個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)降低?0.6?℃；94?℃?變性?20?s，55?℃?退火和延伸?60?s，26?個(gè)循

環(huán)。反應(yīng)利用?96?孔?PCR?板在?PCR?擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

7.3基因分型檢測

在微孔板熒光分析儀上讀取熒光信號(hào),使用熒光結(jié)果處理軟件按照分型明確、NTC(無樣品陰性對

照)無特異性擴(kuò)增的原則進(jìn)行樣品?SNP?分型。

7.4數(shù)據(jù)采集與判定

7.4.1數(shù)據(jù)記錄

純合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為?X/X?和?Y/Y，其中?X、Y?為同一位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異；雜合

位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為?X/Y；缺失位點(diǎn)等位變異數(shù)據(jù)記錄為?-/-。

7.4.2品種鑒定的判定

根據(jù)送檢樣品在?40?個(gè)?SNP?位點(diǎn)基因型的差異進(jìn)行品種鑒定，具體判定標(biāo)準(zhǔn)如下：

——差異位點(diǎn)數(shù)≥?4，判定為不同品種；

——差異位點(diǎn)數(shù)≥?1且≤?3，判定為近似品種；

——差異位點(diǎn)數(shù)=?0，判定為極近似或相同品種。

對利用附錄B中40組引物仍未檢測到≥?4個(gè)差異位點(diǎn)數(shù)的樣品，必要時(shí)可增加自行篩選引物進(jìn)行

檢測。

7.4.3純度鑒定的判定

品種純度按照下列公式計(jì)算：

品種純度%（自交系）=（供檢種子粒數(shù)-非本品種種子粒數(shù)）/供檢種子粒數(shù)×100%

品種純度%（單交種）=（供檢種子粒數(shù)-母本種