2020-08-20填料壽命研究指導 1一、層析填料壽命衰減的影響因素 2二、有效降低層析填料壽命的衰減 3三、層析填料壽命的界定 6四、層析填料壽命驗證實驗設計攻略 8五、層析填料壽命驗證(重要) 9六、GMP審查中填料壽命驗證之供應商審查 七、案例分享 匯總：孟旭1層析填料在生物藥物生產中屬于關鍵原材料?！吨袊幍洹?015年版第三部《生物制品生產用原材料及輔料質量控制規(guī)程》中，層析填料分類為第3級中等風險的原材料，需要進行相應的質量控制。近幾年來，對層析填料的管理和驗證已成為法規(guī)監(jiān)管和現(xiàn)場核查的重點項目之一?！吨袊幍洹?015年版第三部《人用重組單克隆抗體制品總論》則明確提出了要對純化用材料(如層析柱填料)的重復使用的可接受程度進行驗證，即層析填料的壽命驗證。在ICH,FDA以及EMA的相關的法規(guī)中早已明確需要需要對層析填料的使用壽命進行驗證。層析技術是生物制藥下游工藝中的核心技術，在生物制藥工藝中層析工藝占有較高的成本，生物制藥下游工藝成本中層析工藝通常會高達60%以上，而層析填料作為層析過程的核心耗材，層析填料的使用壽命直接關系到整個層析工藝的成本。層析填料的重復使用可大大降低生產工藝成本，但同時層析填料的性能也會隨著重復使用次數的增加而降低。層析填料的性能包括動態(tài)結合載量，回收率，對產品相關雜質和工藝相關雜質的去除率，以及層析介質自身屬性(如配基密度，粒徑分布，壓力/流速曲線等)。層析填料性能的降低直接影響終產品藥物的安全性和有效性。因此，從工藝成本和工藝性能的角度上，也需要對層析填料的使用壽命進行嚴格和科學的界定。那么我們如何有效的降低層析填料壽命的衰減呢?信息來源于網絡，僅供大家參考學·!2一、層析填料壽命衰減的影響因素層析填料隨著其重復的裝柱，重復接觸待純化的樣品，層析工藝過程的各種緩沖液，維護保養(yǎng)(再生，清洗CIP,消毒，保存)過程而使其動態(tài)載量及收率下降，非特異性吸附反壓增大的變化導致的壽命衰減或者終止。層析填料壽命的衰減會影響整個工藝過程的成本，且衰減導致填料性能的變化而不能持續(xù)有效的滿足工藝要求。層析填料壽命衰減因素分析：每次裝柱的過程都涉及到填料的脫氣處理，及裝填柱床時的壓縮柱床，然后脫氣時的超聲或者抽濾都會對填料施壓，壓縮柱床也要對填料施壓，反復的施壓及壓力控制不當也會使填料的物理性能發(fā)生變化從而影響填料的壽命。每次裝柱的過程都涉及到填料的脫氣處理，及裝填柱床時的壓縮柱床，然后脫氣時的超聲或者抽濾都會對填料施壓，壓縮柱床也要對填料施壓，反復的施壓及壓力控制不當也會使填料的物理性能發(fā)生變化從而影響填料的壽命。(柱床被嚴重污染或者進氣泡時，拆裝清洗比CIP效果更好，更有利于填料壽命衰減的降低)a.樣品澄清度：樣品越澄清對填料的壽命衰減影響越小。b.樣品粘度：樣品的粘度越小，對填料壽命的影響越小。c.樣品酸堿度：過酸過堿都會加速填料壽命的衰減。d.樣品離子強度：離子強度越高填料壽命衰減的越快。e.樣品成分組成：樣品成分越復雜，層析過程越復雜，填料的壽命衰減越快(這也與填料所處的工藝階段吻合，捕獲粗純階段填料壽命衰減的更快，精純階段填料壽命衰減的慢。)3.層析工藝a.柱床高度，流速及反壓越大，工藝過程填料受到的外力就會增大，填料的壽命衰減就會增大。b.層析工藝過程的緩沖液的種類及洗脫的CV數也會影響填料的壽命，緩沖液越溫和對填料壽命衰減影響越小，洗脫CV數越小對填料壽命衰減影響越小。3合理的維護保養(yǎng)過程可以降低填料壽命的衰減，但是維護過程的CIP及消毒過程通常都需要劇烈的條件，如強酸強堿等，所以CIP的強度及頻率越大對填料的壽命衰減影響越大。a.再生：恢復介質原有功能b.清洗(CIP):去除填料中積累的雜質及污染物，比再生劇烈c.消毒：去內毒素及微生物d.保存：使用后合理保存(溫度，保存液)二、有效降低層析填料壽命的衰減上面介紹了填料壽命衰減的影響因素，針對這些因素我們可以通過一些方式有效降低其對壽命衰減過程的影響。1填料的認知在層析工藝之前我們要對層析的耐壓性，化學穩(wěn)定性(如化學耐受性),物理穩(wěn)定性(如壓縮因子),保存條件，分離原理，材質做足夠的認識，避免不合適的層析過程影響填料的壽命衰減(如IDA-Ni應避免接觸氧化劑還原劑和螯合2樣品的認知在層析工藝的時候我們要對我們的樣品做足夠的認知，包括樣品的濃度，樣品的組成等做一定的了解(如上游工藝，如真核細胞分泌表達的樣品，要了解其上游工藝，培養(yǎng)基組成，培養(yǎng)過程等的一些添加劑是否對填料的性能及壽命衰減會有影響)。3樣品的前處理a.樣品中的顆粒物質在層析前要進行澄清處理，澄清處理的越徹底，對填料壽命衰減影響越小。b.樣品的粘度要盡量小。c.樣品的組份應滿足層析工藝且對填料的性能沒有影響，必要時可以用匯研生物的脫鹽柱FocudexG-25柱對樣品進行換液處理。4層析工藝4a.優(yōu)化柱床高度使其既滿足工藝指標，又可減少反壓b.優(yōu)化層析緩沖液使其對填料壽命衰減的影響最小(比如洗脫強度的合理溫和可以降低配基的脫落和基質的老化)。c.優(yōu)化層析過程減少非特異性吸附等也可以有效降低填料壽命的衰減過程。5維護保養(yǎng)不同的介質及不同的污染物清洗方法不同，清洗紀要保證清洗效果同時要減少對層析介質的損傷，還要避免清洗試劑對介質的二次污染，選擇合適的清洗方法非常重要。依據層析介質的污染物的種類進行清洗方法，下面分別介紹不同污染物清洗方法的選擇。清洗是去除再生沒有去除的污染物，那么我們就要了解污染物的來源，污染物與物料及工藝階段，工藝過程聯(lián)系緊密。1)捕獲階段，物料通常比較復雜，含有大量的雜質，色素，內素素等，再生往往難以去除干凈，那么待清洗去除的物質也很復雜，清洗過程也很復雜，可能需要多種模式配合作用，同時清洗的頻率和強度都要高。通常使用1個循環(huán)后就要清洗一次。2)中度純化階段，物料已經去除了大部分雜質，通過再生殘留在介質上的污染物就很少了，清洗過程和頻率比捕獲階段就要低很多。使用5-10個循環(huán)后就需要清洗一次。3)精純階段，物料已很純凈，只含有微量的雜質，再生通常就可以達到清洗的目的，此時清洗的頻率和強度就更低。根據小試確定的清洗需要開始的狀態(tài)進行清洗。a可溶性雜蛋白的清洗可溶雜蛋白主要是HCP,可溶性雜蛋白主要是由介質的非特異性吸附或者洗脫強度過低引起的，這個在我們再生的時候通常已經去除干凈，若介質被可溶性雜蛋白污染，再生和清洗的過程往往可以合并為一步。1)離子交換介質用2M的氯化鈉洗1-2CV,接觸時間控制在15-30min,若清洗完保存，則需要用10mM氫氧化鈉或者20%的乙醇流經柱床即可。2)疏水層析被可溶性蛋白污染時，可用低濃度緩沖或者超純水，或者30%的異丙醇清洗2-3CV即可，53)凝膠過濾介質被可溶性雜蛋白污染時，可用2M的氯化鈉或者0.1-0.5M的氫氧化鈉清洗1CV即可。4)親和層析被可溶性蛋白污染時，清洗要一句親和層析的類型進行選擇。層析介質被可溶性蛋白污染時清洗過程可和再生過程合二為一同時進行。b固化的蛋白(沉淀或聚集)的清洗固化在介質中的蛋白，是介質在使用的過程中，蛋白變性后沉淀在介質，也有可能是介質使用時介質中高密度蛋白聚集而成沉淀(這與物料的性質有關)。固化在介質中的蛋白嚴重影響介質的性能，要及時清洗。1)凝膠過濾介質，疏水介質，離子交換介質通常都可以通過0.5-1M的氫氧化鈉進行清洗1-2CV即可，清洗完后要立即用水清洗到中性。2)親和介質的種類多，親和介質被沉淀的蛋白污染時要依據親和介質的種類及耐受性選擇合適的清洗方法，部分可通過尿素或等蛋白變性劑清洗1-2CV.c疏水性蛋白的清洗疏水性蛋白污染介質時，離子交換介質，疏水介質，凝膠過濾介質用3-4M的氫氧化鈉清洗3-4CV,然后立即用水洗到中性。親和層析介質則要根據其種類選擇合適的方法清洗。d脂類物質的清洗等非離子型去污劑清洗3-4CV,或者30%異丙醇及70%e核酸的清洗用1M氯化鈉加1M氫氧化鈉清洗1-2CV,親和層析介質需要摸索清洗方法。f色素的清洗色素是一類物質，不同來源的色素的清洗過程差異較大，可根據介質的性質及色素的性質進行清洗，堿洗，酸洗，有機溶劑，及去污劑，變性劑都可以嘗試。g內毒素及微生物的清洗內素素及微生物的清洗通常用0.5-1M的氫氧化鈉清洗1-2CV之后，在用超純水沖洗至中性。親和層析介質可通過0.5%的非離子型去污劑及有機溶劑的方式清洗內毒素。清洗過程注意事項：61)清洗過程要綜合考慮污染物的類型及介質的種類，清洗時要減少對介質2)清洗時通常需要多種方法組合使用，清洗過程并非是固定不變的。3)清洗試劑應選擇純度高的試劑，避免二次污染。4)清洗之后要立即洗到中性保存。5)清洗狀態(tài)的確定及方法的確定要結合整個工藝過程。6)清洗之后要對清洗過程進行驗證，保證清洗目的實現(xiàn)，可通過測定載量，流速等介質的性能指標驗證。6層析設備的選擇層析柱的分布器，清洗死角，密封性，材質也會影響層析填料的壽命。三、層析填料壽命的界定層析填料壽命的界定通常指在特定工藝條件下使用過程中，從開始使用到使用時與設定的工藝指標發(fā)生偏差的使用次數。1、工藝指標與填料指標-目標產品：純度，收率-雜質性質：含量，種類-層析過程：色譜曲線，載量，反壓等1.2填料性能：-清洗后性能恢復2層析填料壽命驗證的進行2.1評價參數層析填料壽命驗證的評價參數主要包括以下四個方面(1)層析填料和層析柱相關指標：柱效(HETP和As),壓力/流速性質，層析填料配基密度等；7(2)層析行為相關指標：UV,pH和電導層析圖譜，層析收集液體積；(3)產品評價相關指標：包括產品的收率，純化，產品相關雜質以及工藝相關雜質的殘留，污染物(微生物和內毒素)的殘留等；(4)空白運行：相關雜質的殘留(Carryover);2.2分析方法對2.1中的評價參數需要建立相應的分析方法。此時的分析方法已經完成了相應的方法學驗證，并且是商業(yè)化生產時所用的方法。常用的分析方法見表1。評價參數層析柱評價參數HETP和As柱效測定(UNICORN)壓力/流速曲線壓力/流速曲線測定(UNICQRN)層析介質特性DBC,配基密度，粒徑分布層析行為評價參數層析圖譜層析圖譜疊加分析(UNICORN)產品評價參數收率蛋白濃度分析(A280)純度(分子量，電荷)SEC-HPLC,GC-HPLC,IEC-HPLC,SDS,iCIEF相關雜質ELISA(HCP,proteinA),qPCR(DNA)等其他空白運行層析圖譜，蛋白濃度，SDS并不是所有循環(huán)次數的樣品都要進行全檢，如表2所示，可以每隔N次的留樣樣品進行全檢，其余的循環(huán)次數的樣品可進行簡單的檢測，比如層析圖譜，蛋白濃度，SDS等。空白運行的樣品可只進行相應雜質殘留的檢測。但是，每個循環(huán)次數的樣品都要留樣，留樣體積及其保存溫度可參考表3。表2留樣樣品的分析方法循環(huán)次數收率圖譜ProteinA每隔N次TTTTTTT空白運行TTTNTNTNTNT所有次數TTNTNTNTNTNT8留樣體積保存溫度A280ProteinA2.4接受標準層析填料壽命終結的標準可以有兩種定義，一是可以直接設置一個極限數值，比如收率小于90%,純度低于95%或者HCP含量高于某一個特定的數值。二是可以采用統(tǒng)計學的方法，當評價參數發(fā)生統(tǒng)計學意義上的趨勢改變時，設定為填料的壽命終結。層析技術是生物制藥下游工藝中的核心技術，在生物制藥工藝中層析工藝占有較高的成本，生物制藥下游工藝成本中層析工藝通常會高達60%以上，而層析填料作為層析過程的核心耗材，層析填料的使用壽命直接關系到整個層析工藝的成本。如何設計層析填料壽命驗證的實驗呢?1、填料壽命驗證的理論依據：層析介質的壽命界定是通過使用過程工藝指標的偏差去判斷的，那么驗證壽命就是使用過程偏差發(fā)生之前的使用過程的積累。驗證是通過小試實驗數據的積累統(tǒng)計分析去完成的。小試驗證實驗是為中試及生產提供可靠的依據，在設計小試實驗時，就要明確層析過程線性放大的各種因素及對層析過程有影響的各種因素，綜合層析過程放大因素及層析過程影響因素來設計小試驗證實驗?！緦游鲞^程放大因素】91)須保持一致的因素：柱床高度，層析柱及層析系統(tǒng)類型，線性流速，樣品狀態(tài)及屬性，層析過程(平衡，清洗，洗脫體積數及緩沖液種類),清洗試劑2)可線性放大因素：體積流速，柱床體積?！緦游鲞^程影響因素】環(huán)境溫度對層析過程有一定影響，特別在疏水層析過程中，環(huán)境因素對層環(huán)境潔凈程度對層析過程，特別是精純階段及去內毒素時影響很大。人為因素，最難控的因素對層析過程的影響也很大。建立SOP及有效可靠的過程監(jiān)控方法是避免人為因素對層析過程的穩(wěn)定可靠的一種方式。【壽命驗證小試實驗設計】1)在設計小試驗證實驗時需保證層析過程放大因素和中試及生產規(guī)模保持一致的因素完全一致，可根據層析過程中的可線性放大因素設計試驗規(guī)模及層析2)避免層析過程影響因素對結果的影響。設計小試實驗室必須在生產所要求的環(huán)境溫度及潔凈車間進行，并且嚴格執(zhí)行過程SOP,且要對過程進行可靠3、填料壽命驗證實驗設計壽命驗證實驗設計必須能夠完全反映商業(yè)化生產規(guī)模的性能，壽命驗證實驗必要要商業(yè)化生產規(guī)模之間的相關性。壽命驗證要能完全反應規(guī)?；a的性能，故而壽命驗證實驗的設計要能夠實現(xiàn)工業(yè)化放大，壽命驗證實驗是將工業(yè)生產工藝在一定比例(1:1000-1:100000)上進行實驗驗證。五、層析填料壽命驗證(重要)壽命驗證實驗設計必須能夠完全反映商業(yè)化生產規(guī)模的性能，壽命驗證實驗必要體現(xiàn)商業(yè)化生產規(guī)模之間的相關性。1.壽命驗證實驗需和工業(yè)生產一致的因素a.柱床高度b.線性流速c.填料型號d.樣品在柱床中的保留時間e.樣品的狀態(tài)及屬性(濃度，組成，前處理工藝)f.層析過程(平衡，上樣，清洗，洗脫CV數及緩沖液種類)g.清洗試劑的種類及清洗過程h.環(huán)境溫度2.壽命驗證和工業(yè)生產可線性縮小的因素a.柱床體積b.層析柱直徑c.體積流速e.層析體積(平衡，清洗，上樣，洗脫體積)3.需注意事項a.柱效b.柱壁效應c.設備放大管路及檢測器檢測范圍和靈敏度差異4.壽命驗證實驗的驗證a.色譜峰的峰形(UV,pH及電導)b.產品收率c.產品純度d.產品含量(洗脫濃度及總量)e.雜質(種類及含量)六、GMP審查中填料壽命驗證之供應商審查中供應商審查都審查什么呢?而是一類標準的統(tǒng)稱。是由TC176(TC176指質量管理體系技術委員會)制定的所有國際標準，是ISO12000多個標準中最暢銷、最普遍的產品。SO9001質量管理體系不僅為我們提供了一套具有科學性的質量管理和質量保證方法及手段，提高了我們內部管理水平，使得內部各類人員的職責明確，辦公效率高。其中文件化的管理體系更是使全部質量工作都有可知性、可見性和可查性。使員工更理解質量的重要性及工作的規(guī)范性，為客戶和潛在的客戶提供信心。在提高企業(yè)的形象，增加競爭的實力，滿足市場準入的要求上具有很重要的制定法規(guī)支持文件(RSF)的先驅，向客戶提供有關工藝層析介質的性能、穩(wěn)定性、可析出化合物，以及分析方法的詳細信息。這些文件內的信息是