1傳統(tǒng)的藥敏實驗

SJKim,TheUnion結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/20242藥敏試驗的目的耐藥監(jiān)測 -評估治療方案 -選擇有效的標準方案病例管理 -診斷耐藥結(jié)核病(耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病）-為個體病例(耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核?。┻x擇有效的方案

結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/20243

問題

?

可靠性:技術(shù)重復(fù)性/臨床反應(yīng)預(yù)

測?

周轉(zhuǎn)時間?操作可行性及可持續(xù)性?成本結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/20244基于標本的藥敏檢測系統(tǒng)直接法直接涂片法（涂片陽性）

優(yōu)點:結(jié)果快;更好的反映耐藥情況

缺點:大多數(shù)藥敏試驗不理想;接種量不容易標化/

可行性較差

-間接法

對結(jié)核分枝桿菌進行培養(yǎng)后進行藥敏試驗

優(yōu)點:更好的控制接種量

缺點:結(jié)果延遲結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/20245以傳統(tǒng)的生長檢測為基礎(chǔ)的藥敏試驗方法

以傳統(tǒng)生長檢測為基礎(chǔ)的方法WHO（1963）的標準方法

絕對濃度法-Meissner

-標化接種量;藥物濃度梯度抗性比率法-Mitchison-克服培養(yǎng)基中藥物濃度變化的缺點

比例法-Canetti/Grosset

-

臨界濃度比例,更好的控制接種量

[GCanetti/JGrosset,France;SFroman,USA;PHauduroy,Switzerland;MLangerova/LSula,Czechoslovakia;HTMahler(WHO);GMeissner,Germany;DAMitchison,England]結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/20246以快速培養(yǎng)生長檢測為基礎(chǔ)的藥敏試驗方法

快培生長系統(tǒng)觀察顯微鏡下的微小菌落:-玻片培養(yǎng);顯微鏡觀察的藥敏試驗（MODS）代謝情況檢測:

-CO2

產(chǎn)生量(放射BACTEC460;

色素變化

MB/Bact3D)-O2

消耗

(熒光產(chǎn)生

MGIT960)-TREK系統(tǒng)

(ESP培養(yǎng)系列

II)-微盤:

阿莫拉藍試驗(指示管)/TEMA-ATP產(chǎn)生,生物熒光試驗

噬菌體檢測:FASTPlaque;Bonxbox(LRP)結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/20247以檢測基因突變?yōu)榛A(chǔ)的快速藥敏試驗系統(tǒng)擴增目標區(qū)的DNA測序

聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù);-探針雜交:反向探針線性雜交方法;Hain

分枝桿菌藥物抗性plus分子燈塔/信標:

GeneXpert系統(tǒng)是一個將樣品準備、定量擴增和熒光檢集于一身并自動進行核酸檢測分析的系統(tǒng);LAMP(Eiken)核酸環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)高效液相色譜應(yīng)用與擴增的DNA的突變檢測結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/20248藥敏試驗的結(jié)果可靠性治療結(jié)果的預(yù)測值-藥敏試驗的耐藥標準試驗可靠性-試驗精確度&可重復(fù)性結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/20249藥敏試驗的校正

獲得最相關(guān)的臨床耐藥標準▽

可能的敏感株的敏感級別▽在治療反應(yīng)變化方面測定敏感性水平?從未接受過治療的患者(PS)與至少接受5/6個月治療的患者(PR)的標本菌株的敏感性進行比較

PS=>100菌株;PR=>50菌株CanttiG,etal.BullWHO1969;41:21-43.結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202410

可能敏感菌株/（可能無耐藥性菌株）在不同藥物濃度下的抑菌分布Minimalinhibitoryconcentrations(MIC)最小抑菌濃度FrequencyofstrainsClinicallysusceptiblestrains(PS)Breakpoint1SD3SD結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202411

不同藥物濃度下可能敏感菌株和可能耐藥菌株最低抑菌濃度的分布

FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)Breakpoint*Technicalvariation(inoculum/media/drugconcent.)Clinicallysusceptiblestrains(PS)Clinicallyresistantstrains(PR)結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202412

不同藥物濃度下可能敏感菌株和可能耐藥菌株最低抑菌濃度的分布FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)PSPR2mcg/mlBreakpoint13.1as“R”75.811.1as“S”結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202413

可能敏感/可能耐藥菌株對利福平的最小抑菌濃度的累積分布（此試驗采用L-J培養(yǎng)基用絕對濃度法）85.8結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202414

不同藥物濃度下可能敏感菌株和可能耐藥菌株最低抑菌濃度的分布

FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)Breakpoint*InoculumvariationClinicallysusceptiblestrains(PS)Clinicallyresistantstrains(PR)結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202415

可能敏感和可能耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對氧氟沙星敏感性分析采用L-J培養(yǎng)基Donotquotethisdata!(n=81)(n=111)結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202416

校正的乙胺丁醇的臨界濃度

(此試驗采用改良羅氏培養(yǎng)基的絕對濃度法)42%50%結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202417

可能敏感和可能耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對卡那霉素敏感性分析InL-JMediumIn7H10Medium67%67%結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202418抗結(jié)核藥物的最低抑菌濃度比平均峰值EMBETHOFXCFXINHRMPKMCPMPASSM結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202419推薦的臨界濃度藥物LJ*7H107H11Bactec460MGIT960異煙肼0.20.20.20.10.1利福平40.01.01.02.01.0乙胺丁醇2.05.07.52.55.0鏈霉素4.02.02.02.01.0吡嗪酰胺NRNRNR100.0100.0卡那霉素30.05.06.04.0阿米卡星40.01.01.0卷曲霉素40.010.010.01.252.5環(huán)丙沙星2.02.02.02.01.0氧氟沙星2.02.02.02.02.0莫西沙星0.50.25加替沙星1.0乙硫異酰胺5.010.02.55.0丙硫異煙胺40.01.252.5PAS1.02.08.02.0環(huán)絲酰胺40.0NRNRNRNR氨苯硫脲NRNRNRNRNR利奈唑酮1.01.0*ProportionWHO推薦藥敏試驗的臨界濃度,2007結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202420抗結(jié)核藥物藥敏試驗程序復(fù)雜:必須在有質(zhì)量保證的實驗室才能實施2.試驗操作危險大:操作只能在擁有好的設(shè)施及設(shè)備的實驗室(BSL-3)進行,而且所有的實驗室工作人員都要熟練的掌握每個程序結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202421影響藥敏試驗結(jié)果的物理化學(xué)環(huán)境因素培養(yǎng)基中活動性/精確的藥物濃度藥粉.試劑效價:劑量/溶解/稀釋/存儲

purityxactivefractionxH2O

EMB:99%purity;C10H24N2O2.2HCl(277.2-72.9=204.3);nowater;0.99x0.74x1.0=0.7326;1000mg→733mg-培養(yǎng)物的制備:(1)滅菌過程中熱失活(2)蛋白結(jié)合;(3)拮抗劑/離子(4)pH值接種量:-接種量/離散度/可代表性-組織物的可行性試驗結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202422濃縮過程中利福平的穩(wěn)定性結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202423抗結(jié)核藥物的儲存在密封的硅膠容器內(nèi)儲存(最好在真空下儲存)結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202424藥敏試驗接種物的制備Inoculate0.1mlvolumeofinoculumontoeachmedium結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202425比例法

(byMiddlebrook&Cohn)Dilute稀釋1mg/mlbacterial

suspensionto10-3&10-5mg/mlbyserial10folddilution.Plant

接種0.1mlontoeachslopeofdrug-freeorcontainingmedium制備培養(yǎng)基Observe觀察thegrowthafter4weeksincubation(ifthegrowthispoor,againafter6weeks).觀察4周生長情況（如果培養(yǎng)基質(zhì)量較差應(yīng)觀察6周）Report

報告theproportionofcoloniesgrownatthecriticalconcentrationofthedrug.在藥物的臨界濃度報告結(jié)果

DrugfreeIsoniazidEthambutolInoculummedia0.2mcg/ml2.0mcg/ml

10-3+++++310-52690%resistant34.60.1InterpretationResistantSusceptible結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202426藥敏試驗結(jié)果-11.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateone

loopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/?orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/?ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/?bacterialsuspension

orifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/?.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(?/?)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4

㎎)13+2+11870TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6

㎎)2282000InterpretationR(7.1)(2/28x100)S(0.03)(1/2800x100)S(0.6)(18/2800x100)S(0.3)(7/2800x100)MTB結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202427藥敏試驗結(jié)果-21.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateone

loopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/?orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/?ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/?bacterialsuspension

orifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/?.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(?/?)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4

㎎)14+2+21+3+0TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6

㎎)22+50010Interpretation?S??MTB結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202428藥敏試驗結(jié)果-31.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateone

loopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/?orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/?ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/?bacterialsuspension

orifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/?.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(?/?)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4

㎎)13515000TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6

㎎)200000InterpretationRR??MTB結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202429藥敏試驗的技術(shù)可靠性外部質(zhì)量評估結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202430

17個跨國參比實驗室網(wǎng)絡(luò)第14輪熟練度測試結(jié)果

（數(shù)據(jù)來源于ArmandVanDeun

2007年）敏感性特異性效能可重復(fù)性Isoniazid異煙肼S敏感=13R耐藥=17Average(%)99999998100%13141114<95%4313Rifampicin利福平S敏感=10R耐藥=17Average(%)99999998100%14141214<95%3323StreptomycinS敏感=11R耐藥=16Average(%)97919594100%121179<95%5688EthambutolS敏感=17R耐藥=4Average(%)88979697100%1113811<95%6476藍色數(shù)字表示實驗室數(shù)量結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202431

51個國家（或地區(qū)）參比實驗室利福平和異煙肼藥敏試驗結(jié)果的一致性

（世界衛(wèi)生組織第四期全球耐藥報告,2008）%Agreement一致性Isoniazid異煙肼Rifampicin利福平10038(77.6)37(72.5)95-996(12.2)9(17.6)90-944(8.2)5(9.8)<901(2.0)0Totalnumberoflabs合計49(100.0)51(100.0)結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法5/9/202432TestDrug藥物敏感性(%)特異性(%)患病情況下的耐藥結(jié)果預(yù)測值(%)1%15%110%130%1KM2100909.2