第一課植物組織培養(yǎng)

教學(xué)重點(diǎn)木章介紹了植物，動物，微生物組織細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞融合的基礎(chǔ)理論和基本實驗技術(shù)，要求學(xué)生重點(diǎn)掌握組織，細(xì)胞的無菌

操作技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞融合技術(shù)了解細(xì)胞克隆的基本原理及重要意義。

學(xué)習(xí)方法：

學(xué)習(xí)要求：

第一課時植物組織培養(yǎng)

-、概述細(xì)胞工程

細(xì)胞工程

細(xì)胞是生物體的結(jié)構(gòu)單位和功能單位

細(xì)胞工程是一種細(xì)胞水平上的遺傳工程，它是將一種生物細(xì)胞中攜帶遺傳信息的細(xì)胞核或染色體整個地轉(zhuǎn)移給另一種生物細(xì)胞，使新

細(xì)胞產(chǎn)生具有人們所需要的功能，從而改變受體細(xì)胞的遺傳特性，打破只有同種生物才能進(jìn)行雜交的限制，為改良品種或創(chuàng)造新品種

開拓了廣闊前景，細(xì)胞工程包含細(xì)胞融合、體細(xì)胞雜交、動植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)核和卵移以及植物組織培養(yǎng)技術(shù)等方面。

簡稱：細(xì)胞工程就是利用細(xì)胞的全能性，采用組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對動、植物進(jìn)行修飾，為人類提供優(yōu)良品和I、產(chǎn)品和保存珍貴物種。

3.1細(xì)胞工程的基本知識

一、細(xì)胞工程的基礎(chǔ)知識與基本技術(shù)

1、基礎(chǔ)知識

細(xì)胞是細(xì)胞工程操作的主要對象。

生物界有兩大類細(xì)胞：原核細(xì)胞如：細(xì)菌、放線菌等與真核細(xì)胞如：酵母、動植物等

名稱分類定義例如特點(diǎn)

細(xì)菌、放線菌

原核細(xì)胞

生物界細(xì)等

胞酵母、動植物

真核細(xì)胞

等

2基本操作

1）、無菌操作技術(shù)

a、細(xì)胞工程實驗條件：無菌條件下進(jìn)行（所有實驗）

b、實驗成功的前提：對生物材料進(jìn)行徹底的消毒與除菌

c、最基本實驗設(shè)備：超凈工作臺

注意：

1、實驗人員一定要有十分嚴(yán)格的無菌操作意識；

2、無菌室應(yīng)定期用紫外線或化學(xué)試劑消毒，實驗前后還應(yīng)各消毒一次；

3、注意周圍環(huán)境的衛(wèi)生整潔；

4、實驗所用的一切器械、器皿和藥品都應(yīng)進(jìn)行滅菌或除菌，實驗者的雙手應(yīng)戴無菌手套。

2）、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

a、細(xì)胞培養(yǎng)是指動物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件卜?的保存和生長。

b、細(xì)胞培養(yǎng)步驟：取材-除菌一材料的預(yù)處理一種于培養(yǎng)基一一培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱--及時收獲或傳代

注意：

1、除了淋巴細(xì)胞可直接抽??；

2、培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，提供各類細(xì)胞生長所需的最佳培養(yǎng)條件，如溫度、濕度、光照、氧氣及二氧化碳等。

3）細(xì)胞融合技術(shù)

細(xì)胞融合：兩個或多個細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分于重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并。

主要過程包括：

①備原生質(zhì)體。由于微生物及植物細(xì)胞具堅硬的細(xì)胞壁，因此通常需用酶將其壁降解。動物細(xì)胞則無此障礙。

②誘導(dǎo)細(xì)胞融合。兩親本細(xì)胞（原生質(zhì)體）的懸浮液調(diào)至一定細(xì)胞密度，按1：1的比例混合后，逐漸滴入高濃度的聚乙二醇（PE

G）誘導(dǎo)融合，或用電激的方法促進(jìn)融合。

③篩選雜合細(xì)胞。將上述混合液移到特定的篩選培養(yǎng)基上，讓雜合細(xì)胞有選擇地長出，其它未融合細(xì)胞無法生長。

經(jīng)過I:述過程就這樣獲得具有雙親遺傳特性的雜合細(xì)胞。

3.2植物細(xì)胞工程

一、植物組織培養(yǎng)

(-)預(yù)備階段(1)選擇合適的外植體是本階段的首要問題。外植體，即能被誘發(fā)產(chǎn)生無性增殖系的器官或組織切段，如一個芽，

一節(jié)莖。選擇外植體，

綜合考慮幾個因素：

①大小要適宜，不宜人小。外植體的組織塊要達(dá)到2萬個細(xì)胞(即5?1Omp)以上才容易成活。

②同一植物不同部位的外植體，其細(xì)胞的分化能力、分化條件及分化類型有相當(dāng)大的差別。③植物胚與幼齡組織器官比會化組織、器

官更容易去分化，產(chǎn)生大量的愈傷組織。愈傷組織原意指植物因受創(chuàng)傷而在傷口附近產(chǎn)生的薄壁組織，現(xiàn)已泛指經(jīng)細(xì)胞與組織培養(yǎng)產(chǎn)

生的可傳代的未分化細(xì)胞團(tuán)。

④不同物種相同部位的外植體其細(xì)胞分化能力可能大不一樣。總之，外植體的這樣，一般以幼嫩的組織或器官為宜。此外，外植體的

人分化及內(nèi)分化的最適條件都需經(jīng)摸索；他人成功的經(jīng)驗只可借鑒。借鑒。人捷徑可循

(2)除上述原肉及共菌選擇外觀健康的外植體，盡可能除個外M休人血的各種微生物是成功進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的前提。J刊D選

懺閃處理時問的長短與外植物對所用試劑的敏感密切相關(guān)。

對外植體除菌的一般程序如下：

外植體一自來水多次漂洗一消毒劑處理一無菌水反復(fù)沖洗一無菌濾紙吸干。

(3)配制適宜的培養(yǎng)基

組織培養(yǎng)基分類

1.含量豐富的基本成分如蔗糖或葡萄糖高達(dá)每升30克，以及氮、磷、鉀、鎂等；

2.微量的無機(jī)物，如：鐵、鎰、硼酸等

3.微量有機(jī)物，如激動素、呵跺乙酸、肌醇等；

(二)誘導(dǎo)去分化階

外植體是已分化成各種器官的切段。組織培養(yǎng)的第一步就是讓這些器官切段去分化，使各細(xì)胞重新處于旺盛有絲分裂的分生態(tài)，因此

培養(yǎng)基中般應(yīng)添加較高濃度的生長素類激素。

(=)繼代增殖階段

愈傷組織長出后經(jīng)過4?6周的迅速細(xì)胞分裂，原有培養(yǎng)基中的水分及營養(yǎng)成分多已耗失，細(xì)胞的有害代謝物已在培養(yǎng)基中積累，因

此必須進(jìn)行移植，即繼代增殖。同時，通過移植，愈傷組織的細(xì)胞數(shù)大大擴(kuò)增，有利于下階段收獲更多的胚狀體或小苗。

(四)生根成芽階段

胚狀體：是在組織培養(yǎng)中分化產(chǎn)生的具有芽端和根端類似合子胚的構(gòu)造。

愈傷組織只有經(jīng)過重新分化才能形成胚狀體，繼而長成小植株。通常要將愈傷組織移置于含適量細(xì)胞分裂素和生長素的分化培養(yǎng)基中，

才能誘導(dǎo)胚狀體的生成。光照是本階段的必備外因。

(五)移栽成活階段

生長于人工照明玻璃瓶中的小苗，要適時移栽室外以利生，此時的小苗還十分幼嫩，移植應(yīng)在能保證適度的光、溫、濕條件下進(jìn)行。

在人工氣候空中鍛煉?段時間能人人他高幼苗的成活率。

植物組織培養(yǎng)圖示為：

預(yù)備階段--誘導(dǎo)去分化階段--繼代增殖階段一一生根成芽階段--移栽成活階段

1、目的:通過組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)完整植株

2、意義：通過組織培養(yǎng)使植物能夠進(jìn)行快速繁殖，多種具有重要的經(jīng)濟(jì)價值的植物實現(xiàn)了大規(guī)模的工業(yè)化、商品化生產(chǎn)。

二、植物細(xì)胞培養(yǎng)

植物細(xì)胞培養(yǎng)：

是指把高等植物的細(xì)胞從植物體內(nèi)分離出來，并在比較簡單的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

植物中含有數(shù)量極為可觀的次生代謝物質(zhì)。據(jù)保守的估計，目前已發(fā)現(xiàn)的植物天然代謝物已超過2萬種，而且還在以每年新發(fā)現(xiàn)1600種

的速度遞增。我們祖先在與疾病的抗?fàn)幹幸逊e累了豐富的利用植物中的生物活性物質(zhì)治病強(qiáng)身的經(jīng)驗。李時珍(1593)編篡的巨著《本草

綱目》中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物。目前仍有約25%的法定藥品來自植物。然而植物生長緩慢，自然災(zāi)害頻繁。即使是大規(guī)模

人工栽培仍然不能從根本上滿足人類對經(jīng)濟(jì)植物日益增長的需求。因此早在1956年，Routier和Nickell就提出工業(yè)化培養(yǎng)植物細(xì)胞以提

取其天然產(chǎn)物的大膽設(shè)想。

工業(yè)化植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的特性:

名稱分類適應(yīng)培養(yǎng)量缺點(diǎn)

工業(yè)化倫物細(xì)胞培懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)大量快速地增殖細(xì)胞不利于次生物質(zhì)的積累

養(yǎng)系統(tǒng)固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞生長緩慢而次生物質(zhì)次生物含量相對較高

1、植物細(xì)胞培養(yǎng)目的：通過組織培養(yǎng)方法培育完整植株；

2、植物細(xì)胞培養(yǎng)意義：

①.許多雜合的重要經(jīng)濟(jì)作物通常是以無性方式繁殖一植物細(xì)胞培養(yǎng)，可以保存每一栽培品系的優(yōu)良性狀；

②.培養(yǎng)用于無性繁殖，大大增加了無性繁殖的范圍和潛力，細(xì)胞培養(yǎng)能夠提高繁殖速度，?個優(yōu)良品種，用細(xì)胞培養(yǎng)再分化植株的方法,

在幾個月內(nèi)就能大面積種植，而常規(guī)的育種法需要好幾年；

③.胞培養(yǎng)能使以前不能進(jìn)行無性繁殖的植物易于繁殖；

④.物細(xì)胞培養(yǎng)在生物科學(xué)研究以及提供醫(yī)藥產(chǎn)品等方面也有著廣闊的情景。

3、培養(yǎng)方法

懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)

①.半連續(xù)培養(yǎng)方法，目每隔?定時間（如1--2天）收獲部分培養(yǎng)物，再加人等量培養(yǎng)基的方法。

②.連續(xù)培養(yǎng)方法，即培養(yǎng)若于天后連續(xù)收獲細(xì)胞的同不斷補(bǔ)充培養(yǎng)液的方法。

總之：這兩個系統(tǒng)較明顯地提高了細(xì)胞的生產(chǎn)率，但由收獲的是快速生長的細(xì)胞，其中的次生代謝物含量依然很低?？磥碛斜匾刂撇煌?/p>

的參數(shù)數(shù)分階段培養(yǎng)細(xì)胞。如前階段營養(yǎng)足，加大通氣，促進(jìn)細(xì)胞大量生長，后階段由于營養(yǎng)短缺。溶解氧供應(yīng)不足導(dǎo)致細(xì)胞代謝途徑改

變，轉(zhuǎn)而累積較高含量的次生物質(zhì)。

固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

細(xì)胞固定化是將細(xì)胞包埋在惰性支持物的內(nèi)部或貼附在它的表面。

定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)有以下兩大類

（1）平床培養(yǎng)系統(tǒng)。如（圖3-1）

本系統(tǒng)由培養(yǎng)、液罐和動泵等構(gòu)成（圖3T）。新鮮的細(xì)胞被固定在床底部由聚屏烯等材料編織成的無菌平墊匕無菌液罐被緊固定在培

養(yǎng)床的上方，通過管道向下滴注培養(yǎng)液。培養(yǎng)床上的營養(yǎng)液再通過動泵循環(huán)送回中，本系統(tǒng)設(shè)備較簡單，比懸浮培養(yǎng)體系能更有效地合成

次生物質(zhì)。不過它占地面積大，累積次生代謝物較多的滴液區(qū)所占比例不高；而且在這密封的體系中氧氣的供應(yīng)時常成為限制因子，經(jīng)常

還得附加提供無菌空氣的設(shè)備。

立柱培養(yǎng)系統(tǒng)。如：下圖

講述語音：本方法將植物細(xì)胞與瓊脂或褐藻酸鈉混合，制成一個個b2cm3的細(xì)胞團(tuán)塊，并將它們集中于無菌立柱中，（圖3-3）。這樣，

中下滴的營養(yǎng)頁流經(jīng)大部分細(xì)胞，亦即"滴液區(qū)"比例大大提高，次生物質(zhì)的合成大為增強(qiáng)，同時占地面積大為減小。

植物細(xì)胞平床培養(yǎng)系統(tǒng)粒物鈿L建福東系統(tǒng)

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..............圖3-1...........................................圖3-2.........................

以下簡要介紹褐藻酸鈣固定植物細(xì)胞的技術(shù)路線：

大量培養(yǎng)植物細(xì)胞

配制2%褐藻酸鈉混合注入尼龍網(wǎng)氯化鈣溶液浸浴褐藻酸圖3T

鈣固定的細(xì)胞團(tuán)

在立柱培養(yǎng)系統(tǒng)中，由于細(xì)胞被固定化，因此應(yīng)盡可能選擇那些次生物質(zhì)能自然地或經(jīng)誘導(dǎo)后能逸出胞外的細(xì)胞株系。此外，為了提高次

生物的產(chǎn)量還應(yīng)注意：

①要選用高產(chǎn)細(xì)胞株系。

②在營養(yǎng)液中加入目的產(chǎn)物的直接或近直接前體物質(zhì)，往往對增產(chǎn)目的產(chǎn)物有特效/。

③對各類細(xì)胞的培養(yǎng)都應(yīng)反復(fù)摸索碳源，氮源和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的配比，找出最佳方案。

④適量光照幾通氣在多數(shù)情況下有利丁產(chǎn)物的生成。

第三課植物細(xì)胞原生質(zhì)體制制備與融合

二、植物細(xì)胞原生質(zhì)體制制備與融合

1、原生質(zhì)體

?，F(xiàn)的雜交育種由于物種間難以逾越的天然屏障而舉步維艱。科學(xué)家們受細(xì)胞全能性理論及組織培養(yǎng)成功的啟示，逐漸將眼光轉(zhuǎn)向細(xì)

胞融合，試圖用這種嶄圖3-2

新的手段沖破自然界的禁鋼。1937年michel率先實施植物細(xì)胞融合的試驗。如何去除堅韌的細(xì)胞’接成了牛物學(xué)工作者必須解決

的首要難題。1960年該領(lǐng)域終于出現(xiàn)了重大突破。由英國諾丁漢大學(xué)Cocking教授領(lǐng)導(dǎo)的小組率先利用真菌纖維素酶，成功地制

備出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根細(xì)胞原生質(zhì)體，開辟了原生質(zhì)體融合研究的新階段。

植物細(xì)胞原生質(zhì)體是指那些已去除全部細(xì)胞壁的細(xì)胞。

2、原生質(zhì)體制備

(1)取材與除菌為了讓制得的原生質(zhì)體一般都生活力較強(qiáng)，再生與分生比例較高。常用的外植體包括：種子根。子葉、下胚軸、胚

細(xì)胞、花粉母細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和嫩葉。

對外植體的除菌要因材而異。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞一般無需除菌。對較臟的外植體往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2?3次，然后浸人7

0%酒精消毒后，再放進(jìn)3%次氯酸鈉處理。最后用無菌水漂洗數(shù)次，并用無菌濾紙吸干。

(2)酶解現(xiàn)以葉片為例說明如何制備植物原生質(zhì)體。①配制酶解反應(yīng)液：反應(yīng)液應(yīng)是一種PH值在5?5?5?8的緩沖液，內(nèi)合

纖維素酶0.3%?3.0%以及滲透壓穩(wěn)定劑、細(xì)胞膜保護(hù)劑和表面活性劑等，②酶解：除菌后的葉片撕去下表皮切塊放人反應(yīng)液不

時輕搖(條件25℃?30℃,2?4h)反應(yīng)液轉(zhuǎn)綠。

反應(yīng)液轉(zhuǎn)綠是酶解成功的?項重要指標(biāo)，說明已有不少原生質(zhì)體游離在反應(yīng)液中。經(jīng)鏡檢確認(rèn)后應(yīng)及時終止反應(yīng)，避免脆弱的原生質(zhì)

體受到更多的損害。

(3)分離

在反應(yīng)液中除了大量的原生質(zhì)體外，尚有一些殘留的組織塊和破碎的細(xì)胞。為了取得高純度的原生質(zhì)體就必需進(jìn)行原生質(zhì)體的分離。

可選取200-400目的不銹鋼網(wǎng)或尼龍布j叭i過濾除渣，也可采用低速離心法或比重漂浮法直接獲取原生質(zhì)體。

(4)洗滌

剛分離得到的原生質(zhì)體往往還含有酶及其他不利于原生質(zhì)體培養(yǎng)。再生的試劑，應(yīng)以新的滲透壓穩(wěn)定劑或原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心洗滌2?

4次。

(5)鑒定

只有經(jīng)過鑒定確認(rèn)已獲得原生質(zhì)體后才能進(jìn)行下階段的細(xì)胞融合工作。由于已去除全部或大部分細(xì)胞壁，此時植物細(xì)胞呈圓形。如果

把它放人低滲溶液中，則很容易脹破。也?！瘡S月熒光增白劑染色后置紫外顯微鏡下觀察，殘留的細(xì)胞壁呈現(xiàn)明顯熒光。通過以上觀測，

基本上可判別是否原生質(zhì)體及其百分中此外，尚可借助臺盼藍(lán)活細(xì)胞染色、胞質(zhì)環(huán)流觀察以及測定人、作用、呼吸作用等參數(shù)定量檢

測原生質(zhì)體的活力。

4、原生質(zhì)體的融合

(1)化學(xué)法誘導(dǎo)融合化學(xué)法誘導(dǎo)融合無需貴重儀器，試劑易于得到，因此一直是細(xì)胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇(PEG)

納合成鈣高PH誘導(dǎo)融合法已成為化學(xué)法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的主流。以下簡介此方法(在無菌條件下進(jìn)行)：

按比例混合雙親原生質(zhì)體----滴加PEG溶液，搖勻，鄢置——滴加高鈣高pH值溶液，搖勻，靜置-----滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌

數(shù)次——離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)?篩選、再生雜合細(xì)胞。

<2)物理法誘導(dǎo)融合1979年Senda等發(fā)明了微電極法誘導(dǎo)細(xì)胞融合。1981年Zi。。mann等提出了改進(jìn)的平行電

極法，現(xiàn)簡介如下：

將雙親本原生質(zhì)體以適當(dāng)?shù)娜芤簯腋』旌虾?，插入微電極，接通一定的交變電場。原生質(zhì)體極化后順著電場排列成緊密接觸的珍珠串

狀。此時瞬間施以適當(dāng)強(qiáng)度的電脈沖，則使原生質(zhì)體質(zhì)膜被擊穿而發(fā)生融合。電激融合不使用有毒害作用的試劑，作用條件比較溫和，

而且基本上是同步發(fā)生融合。只要條件摸索適當(dāng)，亦可獲得較高的融合率。

上述操作實際上是供體與受體原生質(zhì)體對等融合的方法。由于雙方各具幾萬對基因，要篩選得到符合需要且能穩(wěn)定傳代的雜合細(xì)胞是

相當(dāng)困難的。最近，有人提出以X射線、伽瑪射線。紡錘體毒素或染色體濃縮劑等對供體原生質(zhì)體進(jìn)行前處理。輕劑量處理可造成染

色體不同程度的丟失、失活?、斷裂和損傷，融合后實現(xiàn)僅有少數(shù)染色體甚至是DNA片段的轉(zhuǎn)移；致死量處理后合u可能產(chǎn)生沒再僅體

萬染色體w劃她旋余種。利用這種價值不對稱融合方法，大大提高了融合體的生存率和可利用率。

經(jīng)過上述融合處理后再生的細(xì)胞株將可能出現(xiàn)以下幾種類型.

2)親本雙方的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)能融洽地合為一體，發(fā)育成為完全的雜合植株。這種例子不多。

3)融合細(xì)胞由一方細(xì)胞核與另一方細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成，可能發(fā)育為核質(zhì)異源的植株。親緣關(guān)系越遠(yuǎn)的物種，某個親本的染色體被丟失的現(xiàn)

象就越嚴(yán)重。

4)融合細(xì)胞由雙方胞質(zhì)及一方核或再附加少量他方染色體或DNA片段構(gòu)成。

④原生質(zhì)體融合后兩個細(xì)胞核尚未融合時就過早地被新出現(xiàn)的細(xì)胞壁分開。以后它們各自分生長成嵌合植株。

5、雜合體的鑒別與篩選

雙親本原生質(zhì)體經(jīng)融合處理后產(chǎn)生的雜合細(xì)胞，一般要經(jīng)含有滲透壓穩(wěn)定劑的原生質(zhì)體培養(yǎng)基培養(yǎng)(液體或固體)，再生出細(xì)胞壁后

轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基中。待長出愈傷組織后按常規(guī)方法誘導(dǎo)其長芽、生根、成苗。在此過程中可對是否雜合細(xì)胞或植株進(jìn)行鑒別與篩

選。

(1)雜合細(xì)胞的顯微鏡鑒別根據(jù)以卜.特征可以在顯微鏡卜直接識別雜合細(xì)胞：

若一方細(xì)胞大，另一方細(xì)胞小，則大。小細(xì)胞融合的就是雜合細(xì)胞；若?方細(xì)胞基本無色，另一方為綠色，則自綠色結(jié)合的細(xì)胞是雜

合細(xì)胞；如果雙方原生質(zhì)體在特殊顯微鏡卜.或雙方經(jīng)不同染料著色后可見不同的特征，則可作為識別雜合的標(biāo)志；發(fā)現(xiàn)h述雜合細(xì)胞

后可借助顯微操作儀在顯微鏡下直接取出，移置再牛培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(2)以互補(bǔ)法篩選雜合細(xì)胞顯微鑒別法雖然比較可信，但實驗者有時會受到儀器的限制，工作進(jìn)度慢且未知其能否存活與個長遺傳

互補(bǔ)法則可彌補(bǔ)以上不足。

遺傳互補(bǔ)法的前提是獲得各種遺傳突變細(xì)胞株系。

白化互補(bǔ)：不同基山叨的白化突變株出aBxAh,可互補(bǔ)為綠色細(xì)胞株AaBb。

生長互補(bǔ)：甲細(xì)胞株缺外源激素A不能生長，乙細(xì)胞株需要提供外源激素B才能生長，則甲株與乙株融合，雜合細(xì)胞在不含激素A、

B的選擇培養(yǎng)基上可能生長。

抗性互補(bǔ)篩選：假如某個細(xì)胞株具某種抗性(抗青霉素)另一個細(xì)胞株具另一種抗性(如抗卡那霉素)，則它們的雜合株將可在含上述

兩種抗生素的培養(yǎng)基上再生與分裂。這種篩選方式即所謂的抗性互補(bǔ)篩選。

代謝互補(bǔ)篩選：根據(jù)碘代乙酚胺能抑制細(xì)胞代謝的特點(diǎn)，用它處理受體原生質(zhì)體，只有融合后的供體細(xì)胞質(zhì)才能使細(xì)胞活性得到恢復(fù)，

等等。

(3)采用細(xì)胞與分子生物學(xué)的方法鑒別雜合體經(jīng)細(xì)胞融合后長出的愈傷組織或植株，可進(jìn)行染色體核型分析、染色體顯帶分析、同

功酶分析以及更為精細(xì)的核酸分子雜交、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP,見8.2.2.2)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性

DNA(RAPD)分析，以確定其是否結(jié)合了雙親本的遺傳素質(zhì)。

(4)根據(jù)融合處理后再生長出的植株的形態(tài)特征進(jìn)行鑒別質(zhì).

四、單倍體植物誘發(fā)與利用(了解)

單倍體生物是指細(xì)胞中僅含一組染色體的個體。單倍體植物比單倍體動物多見。

在自然界中見到天然誘發(fā)的單倍體植株。它們通常經(jīng)以下途徑發(fā)育而成：

(1)孤雌繁殖途徑植物卵細(xì)胞不經(jīng)受精而發(fā)育成單倍體胚，繼而長成單倍體植株。

(2)孤雄繁殖途徑精于進(jìn)入胚囊后不與卵細(xì)胞受精而獨(dú)自發(fā)育成中倍體胚，再發(fā)育成株。卵細(xì)胞退化消失。

(3)尤融合生殖精卵結(jié)合后，不僅受精卵發(fā)育，由于某種原岡，助細(xì)胞或反足細(xì)胞也與受精卵形成的二倍體胚同步發(fā)育成平倍體胚,

形成雙胚或多胚種子。

(1)、花藥培養(yǎng)

I選取成熟度適中的花蕾或幼穗

1花藥預(yù)處理

1選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基與培養(yǎng)條件

(2)、花粉培養(yǎng)

(3)、未授粉子房或胚珠的培養(yǎng)

(4)、雜交法獲單倍體植株

五、倍體培養(yǎng)物的加倍

1、人工種子(了解)

人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分。激素以及其他成分的人工膠囊。我國雖然起步較遲，但人工種子

的研究已被列入高技術(shù)發(fā)展計劃，在胡蘿卜、黃連。芹菜、營清等植物中獲得大量體細(xì)胞胚，人工種子在無菌條件下的萌發(fā)率已達(dá)90%

以L。

人工種于由以下三部分構(gòu)成如3-3圖：

(1)人工種皮

(2)人工胚乳

(3)胚狀體：胚狀體是由組織培養(yǎng)產(chǎn)生的具有胚芽。胚根雙極性、類似天然種于胚的結(jié)構(gòu)，具有萌發(fā)長成植株的能力。

人工種于作為刀世紀(jì)極具發(fā)展?jié)摿徒?jīng)濟(jì)價值的高科技成果，具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：

①可以不受環(huán)境因素制約，一年四季進(jìn)行工廠化生產(chǎn)；

②由于胚狀體是經(jīng)人工無性繁育產(chǎn)生，有利于保存該圖3-3

種系的優(yōu)良性狀；

③與試管苗相比，人工種子成本更低，更適合于機(jī)械化田間播種心可根據(jù)需要在人工胚乳中添加適量的營養(yǎng)物、激素。農(nóng)藥、抗生素、除

草劑等，以利胚狀體的健康生長。

雖然人工種子的研制歷經(jīng)十幾年已經(jīng)取得了長足的進(jìn)展，但是仍有一些關(guān)鍵技術(shù)尚未攻克。例如，人工種皮的性能尚不盡人意，還未找到

一種符合多數(shù)物種需要的人工胚乳，胚狀體如何讓它處于健康的休眠狀態(tài)，人工種子怎樣做到既延長其保存時間又不明顯降低萌發(fā)率等。

有理由相信，不久的將來，人類終將擺脫大自然的羈絆，實現(xiàn)工廠”化生產(chǎn)植物種子的目標(biāo)。

種子的制備

(1)胚狀體的制備及其同步生長

(2)人工胚乳的制備

工種子

胚狀體

工胚乳

(3)配制包埋劑及包埋人工有'子嚴(yán)一

人工種子的貯存與萌發(fā)

綜上所述，盡管人工種了的研制尚處于實驗室研究階段，但它那令人神往的產(chǎn)業(yè)化前景正吸引著各國政府和科學(xué)家投入巨額資金，付出

個辛勤汗水。成功研制人工種了的美好時刻刻相信不久一定會到來。

2.3動物細(xì)胞工程

—■、1、目的：

2、意義：動物細(xì)胞工程是細(xì)胞工程的個重要分支，它主要從細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的層次，根據(jù)人類的需要，一方面深人探索、改

造生物遺傳種性，另一方面應(yīng)用工程技術(shù)的手段，大量培養(yǎng)細(xì)胞或動物本身，以期收獲細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物以及可供利用的動物。

動物細(xì)胞工程不僅具有重要的理論意義，而且它的應(yīng)用前景電十分廣闊。

二、細(xì)胞組織培養(yǎng)

1、細(xì)胞培養(yǎng)法

(1)培養(yǎng)動物細(xì)胞一般步驟：

(2)無菌取出目的細(xì)胞所在組織，以培養(yǎng)液漂洗干凈。以鋒利無菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊。

(3)將小組織塊置解離液離散細(xì)胞。解離液含蛋白酶類，無鈣。鎂離子。

(4)低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

大量培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞步驟：

(1)微導(dǎo)管培養(yǎng)法

(2)微載體培養(yǎng)法

（3）微膠囊培養(yǎng)法

2、組織培養(yǎng)法

組織培養(yǎng)法與細(xì)胞培養(yǎng)法類似，主要區(qū)別在于省略了蛋白酶對組織的離析作用。

其基本方法如下：

（1）無菌操作取出目的組織，以培養(yǎng)液漂洗。

（2）以鋒利無菌刀具割舍多余部分，將該組織分切成1?Zrnm小塊，移人培養(yǎng)瓶。

（3）加人合適的培養(yǎng)基浸潤組織。小心地將培養(yǎng)瓶平翻180o,擱置15?3Omin,以利組織塊的貼壁生長。

（4）翻回培養(yǎng)瓶，平臥靜置于37。培養(yǎng)。

3、養(yǎng)物的傳代

懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞只需定期吸移原培養(yǎng)細(xì)胞到新鮮培養(yǎng)基即可。

4、無血清培養(yǎng)

無血清培養(yǎng)基由于必須包括血清中的主要有效成分。

包括三大部分：

①基礎(chǔ)培養(yǎng)基，大多以DME培養(yǎng)基與HF12培養(yǎng)基等量混合為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

②基質(zhì)因于一，包括纖粘素、血清鋪展因子、胎球蛋白、膠原和多聚賴氨酸等；

③生長因子、激素和維生素等約30種有機(jī)和無機(jī)微量物質(zhì)，其中包括哺乳動物的絕大多數(shù)內(nèi)分泌激素。

培養(yǎng)基配制繁瑣是無血清培養(yǎng)的最大缺點(diǎn)。國外已有專用無血清培養(yǎng)基商品供應(yīng)，如SFRE199-1和NCTCI35等。

5、養(yǎng)物的長期保存

培養(yǎng)物的長期保存方法基本上有兩大類：經(jīng)典傳代法和冷凍保存法。Carrel是經(jīng)典傳代法的創(chuàng)始人之一和杰出代表，他在極簡陋的

條件卜每隔幾天把雞胚心肌細(xì)胞傳代?次。在令人難以置信的長達(dá)34年的時間里成功地?zé)o菌傳代3400次。

冷凍保存法具有操作簡便、保存期長的特點(diǎn)?，F(xiàn)以其中的液氮保存法為例簡介如下：

（1）將成熟培養(yǎng)物（細(xì)胞）與5%?10%的甘油或二甲亞磯混勻，封裝于若干個安瓶瓶中；

（2）緩慢降溫（每分鐘1?3℃）至一30匕；

（3）繼續(xù)降溫（每分鐘1530℃）至一15（VC；（4）轉(zhuǎn)移至液氮凍存?？蔁o限期保存。若安瓶瓶置一70七冷存，?；钇谕ǔＶ?/p>

有幾個月。在一90匕下培養(yǎng)物可保存半年以上。

6、細(xì)胞組織培養(yǎng)污染的防治

在進(jìn)行細(xì)胞與組織培養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)，都應(yīng)如前所述十分重視滅菌與無菌操作_一旦發(fā)生染菌或交叉感染，搶救工作相當(dāng)麻煩，而且還不一

定能成功。

此外，細(xì)胞系株之間的交叉污染是一個值得重視的問題。一定要突出強(qiáng)調(diào)以下的規(guī)定：在一個工作區(qū)內(nèi)不能同時放置兩種以I：細(xì)胞株，除

非由于細(xì)胞融合等工作需要的暫時存放。同時、兩種細(xì)胞株不能共用培養(yǎng)器具，即使器具消毒后也是如此。

總之，微生物污染與細(xì)胞株間的交叉感染是細(xì)胞、組織培養(yǎng)工作者必須時刻關(guān)注的問題。預(yù)防為主，防治結(jié)合是實驗室工作的指導(dǎo)方針。

三、動物細(xì)胞融合（簡介）

細(xì)胞融合是研究細(xì)胞間遺傳信息轉(zhuǎn)移、基因在染色體上的定位、以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。

動物細(xì)胞融合的途徑有以下三條：

1、病毒誘導(dǎo)融合

自從1958年岡田善雄偶然發(fā)現(xiàn)已滅活的仙臺病毒（HV,副粘液病毒的一種）可誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞相互融合形成多核體細(xì)胞以來，

科學(xué)家已證實，其他的副粘液病毒、天花病毒和疤疹病毒也能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法如下：

2、化學(xué)誘導(dǎo)融合

3、電激誘導(dǎo)融合

細(xì)胞株具備愈多可識別的突變性狀，以它為親本進(jìn)行細(xì)胞融合和篩選也就愈容易做到。

四、單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)（了解）

淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體技術(shù)自1975年問世以來，短短20幾年取得了飛速的發(fā)展，幾乎可以用這項技術(shù)獲得任何針對某個抗

原決定簇的高純度抗體。因此單克隆抗體的應(yīng)用范圍已經(jīng)擴(kuò)大到了生物醫(yī)學(xué)的眾多領(lǐng)域，如免疫學(xué)、細(xì)菌學(xué)。遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等，但目前

主要利用其高特異和高純度的突出優(yōu)點(diǎn)大量應(yīng)用于臨床診斷方面。至今，據(jù)不完全統(tǒng)計，在美國用于免疫檢測的單克隆抗體已占診斷檢測

項目的30%。至IJ2000年，其利潤預(yù)計可達(dá)到100億美元。

單克隆抗體產(chǎn)品之所以應(yīng)用范圍如此之廣，產(chǎn)業(yè)興起如此迅速，是由它本身的特點(diǎn)決定的。

淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)方興未艾，必將在刀世紀(jì)得到更大的發(fā)展。

五、細(xì)胞折合

1、核移植

生物學(xué)家進(jìn)行細(xì)胞核的移植試驗基本上出于兩方面的目的：研究異種核質(zhì)之間遺傳相互關(guān)系；探討已分化細(xì)胞核的遺傳全能性問題。

現(xiàn)簡述如下：

1）異種核質(zhì)關(guān)系研究

細(xì)胞拆合：從不向的細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組分，在體外將它們重新組裝成具生物活性的細(xì)胞或細(xì)胞器的過程稱為細(xì)胞拆合。

細(xì)胞拆臺的研究大多以動物細(xì)胞為材料，其中尤以核移植和染色體轉(zhuǎn)移的工作令人矚目。

1）細(xì)胞核遺傳的全能性

由于科學(xué)技術(shù)發(fā)展水平迅速提高，而且多數(shù)生物學(xué)家轉(zhuǎn)向以未成熟胚胎細(xì)胞克隆動物的領(lǐng)域，井很快取得成效。1981年I1Imen。

率先報告用小鼠幼胚細(xì)胞核克隆出正常小鼠。隨后，世界許多國家和地區(qū)，如美國。英國、新西蘭、中國、臺灣等紛紛報道克隆成功猴、

豬、綿羊、牛、山羊、兔等。不過最讓生物學(xué)家和全世界震驚的重大突破是英國PPL一生物技術(shù)公司羅斯林（Rosilin）研究所的維爾穆

特（Wilmut）博士1997年2月27日在世界著名權(quán)威雜志《Nature》宣布的用乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核克隆出一只綿羊"多莉"（Dolly）

的沈息?！ǘ嗬颉钡恼Q生，既說明了體細(xì)胞核的遺傳全能性，也翻開了人類以體細(xì)胞核競相克隆哺乳動物的新篇章。1998年7月5日，

日本人就喜迎了叫作"能都"和"加賀〃的兩頭克隆牛犢的降牛：幾乎與此同時，一組科學(xué)家介大同檀香