第5章DNA復制

(Chapter4DNAReplication)

1DNA復制概述Chapter4DNAReplication（DNA復制）5.1DNAReplication:AnOverview5.2EnzymologyofDNAReplication5.3BacterialDNAreplication5.4EukaryoticDNAreplication5.5Regulation0fDNAreplicationMolecularBiologyCourse2DNA復制概述

第一節(jié)DNA復制概述

(DNAReplication:AnOverview)

一、基本概念二、DNA的半保留復制三、復制起點、方式和方向四、DNA復制的半不連續(xù)性DNA復制概述一、基本概念DNA復制

親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以各單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP，合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程。

4DNA復制概述復制子(Replicon，復制單位或復制元)

DNA中含有一定復制起點和復制終點的復制單位。AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator復制子的長度大小不均，1.3萬—90萬bp不等。5DNA復制概述在真核生物中，染色體為DNA分子的載體，每條染色體含一個DNA分子。每個DNA分子上含多個復制子。一條染色體上的多數(shù)復制子在細胞周期的S期中，在ATP存在下只復制一次。6DNA復制概述mammaliancell

500-5000bp/min

E.coli，37℃,0.5h,105bp/minDNA復制在細胞周期的S期7DNA復制概述二、DNA的半保留復制

（Semi-ConservationReplication）概念：復制過程中各以雙螺旋DNA的其中一條鏈為模板合成其互補鏈，新生的互補鏈與母鏈構(gòu)成子代DNA分子。8DNA復制概述理論上DNA的復制也可采用其它方式，如另一種叫全保留復制(conservativereplication)的復制方式也是可能的，在這個模型中兩條DNA親代鏈保留在一起作為子鏈合成的模板(圖6-1)。9DNA復制概述DNA復制的兩種模型那么，那一種復制方式更為真實呢？10DNA復制概述Semi-conservativemechanismwasdemonstratedexperimentallyin1958by

MeselsonandStahl--------Proof1

1958Meselson-stahl設計的CsCl超離心試驗證實了DNA復制的這一特性。11DNA復制概述CsCl(Cesiumchloride)densitygradientultracentrifugation（CsCl密度梯度超離心）LabeledE.ColiDNAwith15N14NDNAreplication12DNA復制概述提取DNA，CsCl密度梯度離心細菌在有15N-標記的培養(yǎng)基上生長多代，使DNA雙鏈充分標記轉(zhuǎn)入14N后立即取出繁殖一代后取出繁殖二代后取出13DNA復制概述DNAreplicationE.ColiDNA在15N-標記的營養(yǎng)液中生長多代，使DNA雙鏈充分標記萬有引力將15N-標記的E.Coli

加入14N培養(yǎng)液中細胞在14N中復制1次細胞在14N中復制第2次細胞在14N中復制第3次14DNA復制概述DNAreplicationFigure:TheexpectedresultsoftwogenerationsofsemiconservativereplicationintheMeselson–Stahlexperiment.15DNA復制概述15N標記實驗·細胞生長在15N標記培養(yǎng)基中·轉(zhuǎn)入正常N源培養(yǎng)基中·分離各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N標記DNA未標記DNACsCL密度梯度離心浮力密度

N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml16DNA復制概述17DNA復制概述

三、復制起點、方向和方式1、復制起點（origin，ori或O，復制原點）復制開始處DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：單復制起點，即——整個染色體只有一個復制單位18DNA復制概述AllprokaryoticchromosomesandmanybacteriophageandviralDNAmoleculesarecirclesandcomprise

singlereplications.

（單復制子）19DNA復制概述真核生物（Eukaryote）:多復制起點，即－－一個genome中有多個復制單位20DNA復制概述ATrich富含AT&發(fā)夾結(jié)構(gòu)“呼吸作用”十分明顯，許多酶的結(jié)合位點真核生物的復制原點約300bp±復制起點序列特征21DNA復制概述2、復制方向（復制過程的順序性）復制叉（Replicationfork）：復制時DNA分子中的“Y”形區(qū)域，是由解開的兩條鏈和尚未松解開的雙螺旋形成的。在復制叉區(qū)域發(fā)生雙鏈的不斷分離和新鏈的合成,代表DNA復制中的生長點。復制叉從起始點起沿著DNA合成方向連續(xù)向前移動。無論原核或真核細胞，在電鏡下均可看到此種復制現(xiàn)象。DNA復制概述Replicationfork23DNA復制概述復制眼（replicationeye）：電子顯微鏡下觀察正在復制的DNA，復制的區(qū)域形如一只眼睛。24DNA復制概述真核生物的多復制子多個復制眼DNA復制概述ElectronMicroscopyofreplicatingDNArevealsreplicatingbubbles.DNA復制概述

單向復制

雙向復制（1）單雙向復制取決于起點處有一個還是兩個復制叉27DNA復制概述單起點、單方向（原核）多起點、單方向（真核）單起點、雙方向(原核)多起點、雙方向（真核）（2）復制的多模式28DNA復制概述3、復制方式（1）從新起始（denovoinitiation）或復制叉式（replicationfork）或θ型（2）置換式（Displacementform）又稱D環(huán)復制

（3）共價延伸方式（covalence

elongation）或滾環(huán)式復制（rollingcirclereplication）29DNA復制概述DNA復制方式θ型（西塔型）線性DNA雙鏈的復制D-環(huán)型滾環(huán)型30DNA復制概述

（1）從新起始（denovoinitiation）或復制

叉式（replicationfork）或θ

復制AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.31DNA復制概述雙向復制

單、雙向θ

復制模式圖單向復制32DNA復制概述線粒體和葉綠體DNA的復制方式兩條鏈上的復制起點不對應時產(chǎn)生D-環(huán)復制。（2）置換式

Displacementform

又稱D環(huán)復制

33DNA復制概述由于復制時產(chǎn)生的滾環(huán)結(jié)構(gòu)形狀象σ(sigma)，又稱σ復制病毒、細菌因子（3）共價延伸方式

（covalence

elongation）或

滾環(huán)式復制

（rollingcircle

replication）DNA復制概述雙螺旋環(huán)狀親代DNA序列特異性內(nèi)切酶在復制起點產(chǎn)生一個缺口環(huán)狀模板鏈繼續(xù)伴隨3’-OH的共價延伸而“滾動”。單鏈子代DNA經(jīng)切割和重新閉合成環(huán)而產(chǎn)生滾環(huán)式復制

（σ復制）5’-P末端被取代，向3’-OH共價延伸。35DNA復制概述四、DNA復制的半不連續(xù)性

（Semi-DiscontinuousReplication）

36DNA復制概述3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘合成方向的問題：DNA聚合酶只能以5'→3'方向合成DNA，事實上沒有發(fā)現(xiàn)DNA能按3‘→5’合成的證據(jù)37DNA復制概述E.coli[t-]2’’,7’’,15’’,30’’

脈沖標記dT-H3

0℃KCN殺死D.S.DNAS.S.DNA密度梯度離心測定H3-T放射強度脈沖追蹤20℃indT-H330’’正常培養(yǎng)基中數(shù)分鐘

岡崎片段（Okazakifragment）1968

D.S.DNA38DNA復制概述H3-T脈沖追蹤

脈沖標記30’’15’’7’’2’’10S(1kb)40S(Prok.850Nt/sec)新合成的都是1Kb左右的岡崎片段？兩條鏈都是不連續(xù)合成的？？？？39DNA復制概述---A-------T-------A-------T--------G--------C----dUTP

:dTTP=1：300／cell

AUGUdutgenedUTPaseDNA中不能有U?突變頻率=

1/1200！

半不連續(xù)復制的證據(jù)

DNA內(nèi)的dump片段的存在---U------

------A---

---A---

Ungase

ung尿嘧啶-N-糖基酶U少數(shù)dUTP

DNA復制概述UUdenaturedumpfragment~1200base~OkazakifragmentAA41DNA復制概述

以下實驗證實了這個解釋(1)在dut-突變體（dUTPase缺失）中岡崎片段比在dut+中為短。這是因為U摻入機會增加；(2)在ung-（尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突變體中新合成的DNA約有一半由片段組成。這是因為尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不會切除U的糖苷鏈，也就不會出現(xiàn)AP位點，所以堿沉淀時不易斷裂，從而保持了半不連續(xù)的原貌。

42DNA復制概述前導鏈

(dUMP片段長度)

后隨鏈（岡崎片段的長度）

dUMP片段脈沖追蹤

脈沖標記30’’15’’7’’2’’Okazaki片段在某種意義上為

dUMP

片段DNA復制概述

先導鏈(leadingstrand):DNA復制時，與復制叉向前移動的方向一致，以3’→5’鏈為模板，按5’→3’方向連續(xù)合成的一條鏈。先導鏈按

dUMP片段連續(xù)復制后隨鏈（laggingstrand）：按Okazaki片段不連續(xù)復制岡崎片段(Okazakifragment):DNA復制不連續(xù)合成鏈中形成的短DNA片段。44DNA復制概述45DNA復制概述第二節(jié)DNA復制的酶學

EnzymologyofDNAReplication復習：DNA復制

親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以各單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP，合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程。

46DNA復制概述DNA復制的體系底物：

dNTP(dATPdGTPdCTPdTTP)聚合酶（polymerase):DNA-pol

依賴DNA的DNA聚合酶(DDDP)模板（template):

解開成單鏈的DNA母鏈引物（primer):寡核苷酸片段,提供3’-OH末端,使dNTP聚合其它酶和蛋白質(zhì)因子:

解鏈酶，解旋酶，單鏈結(jié)合蛋白，連接酶等47DNA復制概述第二節(jié)DNA復制的酶學

(EnzymologyofDNAReplication)重點一、DNA聚合酶二、DNA連接酶三、與DNA幾何學性質(zhì)相關的酶

48DNA復制概述一、DNA聚合酶DNA聚合酶是催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。是DNA復制的主要酶。全稱叫依賴DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指導的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均縮寫為DDDP。49DNA復制概述(一)DNA聚合酶催化的反應5′→3′的聚合活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性50DNA復制概述1、5′至3′的聚合活性聚合反應的特點：(1)以單鏈DNA為模板(2)以dNTP為原料(3)引物或DNA鏈提供3′-OH(4)聚合方向為5′→3′催化四種dNTP以磷酸二酯鍵一個一個地接到DNA鏈上去

(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi51DNA復制概述hydroxylgroupat3’endofgrowingchain52DNA復制概述deoxynucleotidetriphosphatehydroxylgroupat3’endofgrowingchain53DNA復制概述Pyrophosphate焦磷酸酯(PPi)thisbecomesnew3’endnewphosphodiesterbond54DNA復制概述2、

3’－5’

外切核酸酶活性

校對功能(proofreading)DNApolⅠ,Ⅱ和DNApolⅢ都具有3’→5’外切酶活性，DNApolⅡ是主要的修復酶。55DNA復制概述PPPPPPPPPPTTAAAAGGCCHOPGPCOHGPOHUPOHUPOHGPOHOHAPPPOHAPOHPPPOHCPOHCPPPOHCPOHClops!5'5'3'RNAprimerOHPOHCDNApolymerase(5‘→3'polymerase)(3'→5'exonuclease)lop56DNA復制概述3、5’－3’外切核酸酶活性DNApolⅠ獨有的5’→3’外切活性有以下三個特點：必須有5’－磷酸末端被除去的核苷酸必須是已經(jīng)配對的被除去的可以是脫氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切刻平移）57DNA復制概述PPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPTUTTTAAAAAGGGGGCCCCCHOAPOHOHOHOHOHUOHOHOHnewDNARNAprimerDNApolymerase(5'→3'exonuclease)APOHOHAPOHOHAPOHOHAPOHOHAPOHOHAPOHOH5'5'3'3'58DNA復制概述DNA聚合酶I的切口平移反應（Nicktranslation)59DNA復制概述1957ArthurKornberg首次發(fā)現(xiàn)Infact,thereare5polymerasestodate,althoughwewillfocusonlyon3DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ(二)原核生物的DNA聚合酶（E.coli）60DNA復制概述1.DNAPolymeraseIDNA聚合酶I由一條肽鏈組成，含三種酶活性，蛋白水解酶subtilisin酶解后得到的大片段部分為Klenowfragment，擁有兩個酶活性，去掉了5’→3’外切酶活性。5’

3’exo3’

5’exoPolymerase-CN-36kD67kD(Klenowfragment)NormallyDNApolIcontainsall3domains61DNA復制概述DNApolⅡ：5`→3`聚合酶活性及3`→5`外切核酸酶活性。DNApolⅢ:由10種亞基(αβγδδ’

εθτχψ)組成不對稱異源二聚體。核心酶（αεθ）2.DNAPolymeraseⅡ和Ⅲ62DNA復制概述DNApolⅢ63DNA復制概述DNApolⅢ各亞基的功能α亞基：5′→3′聚合酶活性β亞基：夾穩(wěn)模板鏈并使酶沿模板鏈滑動γ－復合物（γ、δ、δ’、χ、ψ、τ）：促進全酶組裝至模板及增強核心酶活性ε亞基：3′→5′外切酶活性和堿基選擇功能，是復制保真性所必需θ亞基:

可能起組裝作用

64DNA復制概述

亞基形成一個圍繞DNA的環(huán)狀鉗twohalvesofslidingclampclampedpolymerasetetheredonDNA65DNA復制概述66DNA復制概述3.三種大腸桿菌DNA聚合酶特性之比較

特性聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ起始新鏈合成———５’→３’核酸聚合酶+++聚合速度(核苷酸數(shù)/酶分子·分)1000-1200240015000-60000３’→５’核酸聚合酶———３’→５’核酸外切酶+++５’→３’核酸外切酶+——分子量1030090000167500每個細胞分子數(shù)400100？1567DNA復制概述三種大腸桿菌DNA聚合酶的

主要功能DNApolⅠ----主要功能是切除引物，填補岡崎片段產(chǎn)生的空隙及DNA損傷的修復。DNApolⅡ----是主要的修復酶DNApolⅢ----是主要的復制酶68DNA復制概述三種DNA聚合酶在決定DNA合成

方面的共同特性①三種酶都只有５’→３’聚合酶的功能，而沒有３’→５’聚合酶功能，說明DNA鏈的延伸只能從5’向3’端進行。②它們都沒有直接起始合成DNA的能力，只能在引物存在下進行鏈的延伸，因此，DNA的合成必須有引物引導才能進行。③三種酶都有核酸外切酶的功能，可對合成過程中發(fā)生的錯誤進行校正，而保證DNA復制的高度準確性。69DNA復制概述已知的DNA聚合酶只能使鏈按5’－3’方向生長5’OHTCATCAC

5’OH3’pppOH

C++ppi進化中保留的深刻的選擇與適應的化學及功能的根源為什么子鏈DNA延伸方向只能是5’

→3’70DNA復制概述

+ATCG

5’pppOH3’

G

pppOH

GATCG5’pppOH3’

如果DNA的延伸方向是3’→5’71DNA復制概述

+ATCG5’pppOH3’GpppOH5’pppGa、因能量的需要，DNA的5’端必須帶有PPP游離dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNaCl的生理環(huán)境中，使dNTP難以聚合到DNA的5’端

需要其他機制以解脫72DNA復制概述費時、費能、增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗

pppOHATCG+pppApOHTCGppp

OHTCG

ppp

OH

TCGb、堿基發(fā)生錯配后的校正……73DNA復制概述（三）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

復制中延長隨從鏈DNA-pol

沒有其他pol時才起作用DNA-pol

催化線粒體DNA的復制DNA-pol

復制中延長領頭鏈DNA-pol

校讀、修復和填補缺口74DNA復制概述

─────────────────────DNA聚合酶性質(zhì)

----------------------------------------------

α

β

γ

δ

ε─────────────────────分布

細胞核

細胞核

線粒體

細胞核

細胞核分子量(kd)>25036-38160-3001702563’

→5’外切酶活性

無

無

有

有

有5’

→3’聚合作用

有

有

有

有

有主要功能

復制

損傷修復

復制

復制

復制,損傷修復

(隨從鏈)(領頭鏈)─────────────────────表5-2真核細胞中DNA聚合酶的性質(zhì)75DNA復制概述二、DNA連接酶（DNALigase）催化單鏈DNA切口上5’-P和3’-OH形成磷酸二酯鍵DNA復制概述所需條件：

a、切刻的3’－OH和5’－P相鄰

b、切刻各自堿基處于配對狀態(tài)

c、需要能量原核（ATP、NAD）真核（ATP）用途：復制過程中，5’

端RNA引物被置換后切刻的連接，修復、重組77DNA復制概述ATPisanintegral主要

partoftheligationreaction—3’—OH—3’—O—3’—OH78DNA復制概述PPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPTTTTTTAAAAAAGGGGGCCCCCHOOHOHPPDNAligase79DNA復制概述80DNA復制概述

三、與DNA幾何學性質(zhì)相關的酶81DNA復制概述解螺旋酶helicaseDNA拓撲異構(gòu)酶DNAtopoisomerase單鏈DNA結(jié)合蛋白

SSB(singlestrandDNAbindingprotein)解開、理順DNA鏈、維持DNA單鏈狀態(tài)82DNA復制概述(一)解螺旋酶(helicase)模板對復制的指導作用在于堿基的準確配對，而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。只有把DNA解開成單鏈，它才能起模板作用。解螺旋酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復制有關的蛋白質(zhì)，當時稱為rep蛋白。作用是利用ATP供能，解開DNA雙鏈。83DNA復制概述

復制相關蛋白的基因：dnaA、dnaB、dnaC……dnaX相應的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)：DnaA、DnaB、DnaC……DnaX

DnaA：辨認復制起始位點

DnaB：解螺旋酶

DnaC：輔助解螺旋酶使其在起始點上 結(jié)合并打開雙鏈。84DNA復制概述(二)DNA拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase)拓撲：是指物體或圖像作彈性移位而又保持物體不