第第頁(yè)γ—谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ—GT）試劑盒說(shuō)明書γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γGT）試劑盒說(shuō)明書微量法100T/96S注意：正式測(cè)定之前選擇23個(gè)預(yù)期差別大的樣本做猜測(cè)定。測(cè)定意義：γGT是γ谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化GSH降解。γGT催化GSH或者其他γ谷氨?；衔锷系摩霉劝滨；D(zhuǎn)移到受體。也可以催化GSH和其他γ谷氨?；衔锏乃?，產(chǎn)生谷氨酸鹽，在細(xì)胞外谷胱甘肽新陳代謝中起了緊要的作用。測(cè)定原理：γGT催化谷氨酰對(duì)硝基苯胺中γ谷氨酰基轉(zhuǎn)移給N甘氨酰甘氨酸，生成對(duì)硝基苯胺，在405nm有特征光汲?。煌ㄟ^(guò)測(cè)定405nm光汲取加添速率，來(lái)計(jì)算γGT酶活性。自備儀器和用品：低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)整移液器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸餾水試劑構(gòu)成和配制：試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保管。試劑二：粉劑×1瓶，4℃保管。試劑三：液體4mL×1瓶，4℃保管。試劑四：液體14.8mL×1瓶，4℃保管。工作液（在試劑二瓶中配制）：臨用前配制，把試劑三倒入試劑二瓶中，充分溶解（室溫過(guò)低時(shí)可以40℃水浴促進(jìn)溶解）；然后把試劑四倒入試劑二瓶中，混勻后室溫保管。粗酶液提?。?.組織：依照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測(cè)。2.細(xì)菌、真菌：依照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波碎裂細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測(cè)。3.血清等液體：直接測(cè)定。γGT測(cè)定操作:1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)整波長(zhǎng)到405nm，蒸餾水調(diào)零。2.試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱30min（保證無(wú)沉淀）。3.測(cè)定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，180μL工作液，混勻后于405nm測(cè)定10s和70s時(shí)吸光度，記為A1和A2、γGT活性計(jì)算：標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.006x+0.0016，x為對(duì)硝基苯胺濃度，y為吸光值，R2=0.999、a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下（1）.按蛋白濃度計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。γGT（μmol/min/mgprot）=[（A2—A1）—0.0016]÷0.006×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=1.67×[（A2—A1）—0.0016]÷Cpr（2）.按樣本質(zhì)量計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。γGT（μmol/min/g鮮重）=[（A2—A1）—0.0016]÷0.006×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=1.67×[（A2—A1）—0.0016]÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。γGT（μmol/min/104cell）=[（A2—A1）—0.0016]÷0.006×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=1.67×[（A2—A1）—0.0016]÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。γGT（μmol/min/mL）=[（A2—A1）—0.0016]÷0.006×V反總÷V樣÷T=1.67×[（A2—A1）—0.0016]V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×104L；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W：樣品質(zhì)量；V樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積（mL），20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），1min。b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.003x+0.0016，x為對(duì)硝基苯胺濃度，y為吸光值，R2=0.999、（1）.按蛋白濃度計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。γGT（μmol/min/mgprot）=[（A2—A1）—0.0016]÷0.003×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=3.34×[（A2—A1）—0.0016]÷Cpr（2）.按樣本質(zhì)量計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。γGT（μmol/min/g鮮重）=[（A2—A1）—0.0016]÷0.003×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=3.34×[（A2—A1）—0.0016]÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。γGT（μmol/min/104cell）=[（A2—A1）—0.0016]÷0.003×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=3.34×[（A2—A1）—0.0016]÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。γGT（μmol/min/mL）=[（A2—A1）—0.0016]÷0.003×V反總÷V樣÷T=3.34×[（A2—A1）—0.0016]V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×104L；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W：樣品質(zhì)量，g；V樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積（mL），20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)